対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

ONDRI のため、プロトコルを倫理とインフォームド コンセントが得られたベイクレスト高齢者ケア (トロント、オンタリオ、カナダ); のための研究倫理ボードに基づいてセンター中毒と精神的健康 (トロント、オンタリオ、カナダ);エリザベス活気病院 (オタワ、オンタリオ、カナダ);ハミルトン総合病院 (ハミルトン、オンタリオ、カナダ);ロンドン健康科学センター (ロンドン、オンタリオ、カナダ);マクマスター (ハミルトン、オンタリオ、カナダ);オタワ病院 (オタワ、オンタリオ、カナダ);パークウッド病院 (ロンドン、オンタリオ、カナダ);聖ミカエル病院 (トロント、オンタリオ、カナダ);サニーブ ルック健康科学センター (トロント、オンタリオ、カナダ);大学健康ネットワーク トロントの西部の病院 (トロント、オンタリオ、カナダ)。 1 ヒトの血液サンプルから DNA の隔離 プロトコルの適切な倫理とインフォームド コンセントに従ってシーケンス参加者からサンプルを収集します。 高品質の DNA を得るためには、抽出のために血液サンプルを描画します。注: DNA も抽出できます唾液や口腔粘膜から該当の DNA 抽出キットを使用します。 EDTA K2 管内 3 4 mL のサンプルを集める DNA の高収率を取得する血液から抽出、もし容量のサンプルを提供して 〜 12 ml。 中間段階の白血球と赤血球の下相プラズマ、薄いの上部の段階に分数に 750 x g で 20 分間の血液サンプルを遠心します。 使い捨て可能な移動のピペットでサンプルの上部にそれをピペッティングによる血液サンプルからプラズマを削除します。適切にプラズマを破棄または将来の生化学分析-80 ° C で保存用 500 μ 因数を複数に分配します。各サンプルに新しい、滅菌ピペットを使用することを確認します。 血液抽出キット12 (材料表) の製造元の指示に従って血液サンプルから DNA を抽出します。注: 上記で説明したボリュームのサンプルを取得すると、白血球の 〜 3 mL が DNA の抽出に使用する取得されます。 製造元の指示に従って ng/μ L の完全スペクトル分光光度計13 (資材表) を使用しての最初の DNA 濃度を測定します。 ステップ 2 に進みます。また、4 ° C で DNA を保存します。 2. シーケンス ライブラリの準備 5.0 ± 1.0 ng/μ L の最終的な集中を取得する 3 日間にわたって DNA サンプルのシリアル希薄を実行します。 1 M トリス バッファー pH 8.5 に 10 μ M を脱イオン水で希釈します。注: 以降の手順で希釈する必要があります DNA サンプルの数に希釈量が異なります。 手順 1.4 後直接 DNA 希釈を実行している場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は同じ日に DNA 濃度を測定手順 1.4 で行われていた。 測定濃度に基づき、40 μ 10 μ M Tris バッファー pH 8.5 を使用して 〜 10 ng/μ L の DNA を希釈し、4 ° C でその晩にサンプルを許可します。 製造元の指示に従って DNA (材料表) の定量化のため適切な蛍光光度計14 DNA 濃度を測定します。注: サンプルの濃度にする必要があります > 従来の分光光度計の感度のため 10 ng/μ L。 測定濃度に基づいて、10 μ M Tris バッファー pH 8.5 を使用して 10 ng/μ L の DNA の 20 μ L を希釈し、4 ° C でその晩にサンプルを許可します。 製造元の指示に従って蛍光光度計14, DNA 濃度を測定します。 測定濃度に基づいて、5 ng/μ L 10 μ M トリス塩酸 pH 8.5 を使用する DNA の 10 μ L を希釈し、4 ° C でその晩にサンプルを許可します。 ターゲットを絞った NGS パネルの適切なターゲット濃縮キット15 (材料表) の製造元の指示に従って配列ライブラリを準備します。濃縮キットが使用されている NGS プラットフォームに適していることを確認します。 に従って、製造元の指示16コーポレートガバナンスについてと、ライブラリのプールします。注: ONDRISeq、ライブラリ、2 枚セットでプール、12 の DNA のサンプルで構成されています、NGS デスクトップ機器 (材料表) の実行します。単一の反作用で実行できるサンプルの数は、シーケンス キットおよび使用しているプラットフォームによって異なります。 シーケンス データの品質向上を達成するために次のターゲット濃縮キット15のメーカーの説明書に記載されている tagmentation DNA ライブラリの品質を検証するためのオプションの手順を実行します。 各ライブラリ ライブラリ収量の品質を確保するため 3 通を分析します。 ライブラリをプーリング、製造元の指示に従って蛍光光度計14, DNA 濃度を測定します。この濃度を使用して、使用されているターゲット濃縮キットが推奨等モル比を取得するプールに各 DNA ライブラリのボリュームを決定します。 3. 次世代シーケンス NGS デスクトップ機器試薬キット製造元の指示17,18 (材料表) に従ってライブラリをシーケンスします。 製造元の手順18を NGS デスクトップ機器のワークフローにインポートされます適切な NGS 技術ソフトウェア (資材表) を使用してによるとサンプル シートを準備します。注: ONDRISeq のためには、アプリケーションのオプションを選択は、’その他’、FASTQ ファイルのみ要求された (図 1) です。以降の手順は、配置および品質パラメーターの完全なカスタマイズを可能にするため、これらの FASTQ ファイルを処理します。ただし、ターゲット シーケンスを選択する場合いくつかの NGS 楽器は VCF ファイル自体にシーケンス データを処理することができます。製造元の手順18は、オプションの完全な選択の相談があります。 クラウド型コンピューティング環境19 (資材表) を使用している場合実行シーケンスを設定する場合ログインします。NGS デスクトップ楽器ホーム ページを「シーケンス」をクリックした後これを行います。 次の製造元の指示に従ってライブラリ変性18 、蛍光光度計14DNA ライブラリの濃度を測定します。 製造元の指示に従って適切な自動電気泳動システムと DNA 品質解析キット20 (資材表) を用いた DNA ライブラリの品質を検証します。 DNA 濃度を ng/μ L から nM に変換するには、16次の数式を使用して、注: 平均ライブラリのサイズは使用されているターゲット濃縮キットに固有し、ステップ 3.1.4 にみられる電気泳動トレースから取得できます。 6-20 の最終的な集中に配列ライブラリを希釈時、必要に応じて、製造元の手順21によると、600 μ L のボリューム。注: 必要な正確な濃度は使用されるシーケンス キットに依存です。適切な荷重集中を決定する濃縮キット製造元に問い合わせてください。 希釈、変性、製造元の指示に従って肯定的な制御シーケンス ライブラリ21を含みます。 Length(s)、読み取り実行、DNA ライブラリ濃度ロード (pM)、肯定的な制御の追加の割合、試薬カートリッジのバーコード、手順 3.1.1、濃縮キットを使用すると、インデックス読み取りの数で選択したアプリケーションを含むすべてのシーケンスをログに記録し、サンプル シートの名前です。注: NGS デスクトップ計測器の実行時に計測器、濃縮キットによって異なります、読む長さ (この実験22使用シーケンサーの 4-56 h) を選択します。 シーケンスの実行が完了したら、フォルダーにアクセス”実行”、NGS デスクトップ楽器ホーム ページに移動し、「ファイルの管理」をクリックするすべて出力を含む。後でアクセスできるローカル ドライブにファイルを移動します。コンピューター上の別のオプションのナビゲーション パネルに「実行」を選択することによってコンピューティング環境19がクラウド ベース内のファイルを見つけます。適切なシーケンス実行の概要] ページに移動するのに実行を選択します。クラウドからデータを取得する「ダウンロード」を選択します。表示されるダイアログ ボックスからダウンロードして「ダウンロード」をクリックしてファイルの種類として FASTQ ファイルを選択します。 クラウド型コンピューティング環境19,23の概要ページでは、コンピューティング環境によって生成された様々 な数値を使用して実行シーケンスの品質を分析する「グラフ」に移動します。製造元の指示23生産各図の詳細についてを参照してください。 実行のチャートのページからには、「データによってサイクル」というラベルの付いた数字を見つけます。[グラフ]「強度」を選択し、、チャネル「全チャンネル」を選択します。生産この信号強度プロットが同じ濃縮キットと NGS デスクトップ機器で、過去に実行実行シーケンスによって生成されることに似ていることを確認します。注: これはすべての 150 サイクル全体の各拠点は, 強度の割合を反映しています。図は、同じパネルの過去のシーケンス処理の実行と比較する必要があります理由は、濃縮キットによって大きく異なります。 ページの右側にあるインデックスの品質管理 (QC) ヒストグラムを見つけるを実行ナビゲーション パネル内の「インデックス QC」タブを選択します。すべてのサンプル % 読み取り識別 (PF) の比較的均一な分布が観察されることを確認します。注意: 任意のサンプルがある程度低い % 読み取り識別 (PF) サンプルの残りの部分よりも、注意、シーケンス データの品質に影響する可能性があります。 クラウド ベースのコンピューティング環境の [概要] ページで、実行ナビゲーション パネル内の「指標」をクリックして品質基準に移動します。注: 指標カットオフは、使用されているシーケンスのプラットフォームと濃縮キットに依存します。品質管理お勧めの 3 つを強調表示、次の手順を製造元の手順23に基づく利用できる多くの統計情報があります。 「密度 (K/MM2)」の下で確実にクラスター密度濃縮キットが推奨範囲内 (この場合は 1,200-1,400 K/mm2)。 合計”% ≥Q30″の下で値がシーケンスの読み込みの質を反映して 85% であることを確認します。注意: 85% のこのしきい値より低い場合は、シーケンスの品質が下がる場合があります注意しましょう。 「調整 (%)」の下で値が実行シーケンスに含まれていた肯定的な制御 % に似ていることを確認します。注意: これは肯定的な制御の指標として総読み取りのこの割合だけが肯定的な制御ゲノムに合わせて発見されたように働きます。1% の肯定的な制御を使用した場合調整 (%) の ~ 1-5% になることが予想されます。 図 1: NGS 技術ソフトウェア (材料表) のスクリーン ショットのサンプル シート作成者アプリケーション オプションです。ONDRISeq の目的、FASTQ 唯一のアプリケーションが使用されます。ユーザーは、VCF のファイルなど、生成されるその他のファイルをご希望の場合は、ターゲット順序カテゴリ内のアプリケーションを使用することをお勧めします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 4. 順序とバリアントを呼び出す データの前処理のために人間の参照ゲノムに raw FASTQ ファイルを配置し、亜種 (資材表) を呼び出す適切なソフトウェアを選択します。 データの事前処理ソフトウェアにインポート FASTQ シーケンスを読み取ります。注: ONDRISeq のために、24 のサンプルの単一のシーケンスの実行から生成された 48 FASTQ ファイルがインポートされ、ソフトウェアを介して処理されます。一度に処理されるサンプルの数は、研究者のニーズと NGS パネルのサイズによって異なります。 「ナビゲーション領域」内で右クリックし、「新規フォルダー」を選択します。明確に実行シーケンスが実行された、そのフォルダーの名前を付けます。 上部のツールバーから「インポート」を選択します。ドロップダウン リストから示すシーケンス プラットフォームの一覧は、シーケンスを行ったプラットフォームを選んだ。注: ONDRISeq のために、「イルミナ」が選ばれます。ただし、異なるシーケンスのプラットフォーム相談を使用して場合 FASTQ インポートの残りのための取扱手順24です。 ダイアログ ボックスに移動し、FASTQ ファイルを配列から選択しますを実行するが処理されています。複数のサーバー コンピューターを使用している場合は、インポート中のファイルが保存され、ローカル ドライブからインポートを確認します。 「一般オプション」ダイアログ ボックスのシーケンス対最後の化学的性質を使用する場合「対読み取り」横にあるボックスをクリックしてします。注: この場合もあります 2 つ FASTQ サンプル – サンプルごとにインポート前方および 1 つの逆。 ダイアログ ボックスの情報を読み組み合わせから前方読み取り FASTQ ファイルがファイルの一覧で逆読みの前に表示される場合「対・ エンド (逆方向)」を選択します。ファイルは、逆の順序で表示される場合、は、「mate 商品-ペア (上り・下り)」を選択します。1 ペアの読み取りの最小距離と最大距離 1000 サンプル シーケンス内で小規模な構造再配列の検出を実現する設定します。 「イルミナ オプション」、ダイアログ ボックスの選択「削除読み取りが失敗しました、」シーケンスを失敗した読み取りを削除します。NGS デスクトップ楽器が逆多重化の場合、FASTQ ファイルをエクスポートする前にデータは「MiSeq 逆多重化」ボックスをオンして。 「品質スコア」ドロップ ダウン リストから配列のため利用された NGS パイプラインを選択します。ダイアログ ボックスの下部には「次へ」を選択します。メモ: 使われるパイプライン FASTQ ファイル品質スコアの形式に反映されます。選択するパイプラインの詳細については、製造元の手順24を参照してください。 新しいダイアログ ボックス、選択”Save”と”バスユニット独自の個別のフォルダーに各サンプルの FASTQ ファイルを置くにあたりのサブフォルダーを作成します。ダイアログ ボックスの下部には「次へ」を選択します。 新しいダイアログ ボックスから 4.2.1 の手順で作成したフォルダーを選択します。これは FASTQ ファイルをインポートします。ダイアログ ボックスの下部に「完了」を選択し、FASTQ ファイルがインポートされるまで待ちます。ファイルのインポートの状態を表示する「プロセス」タブをクリックしてします。 順序およびバリアントを呼び出すと、製造元の指示に従ってを実行するソフトウェア内でのワークフローを設計します。注: このワークフローは、研究者のニーズによって異なりますが、次の手順は、ONDRISeq (図 2) の目的のために含まれているものを網羅します。このワークフローの手順は、他の順序により、NGS と適切なバリアントの呼び出しソフトウェアに適用できます。人間の参照ゲノム GRCH37/hg19 データ処理と解析の整合性への参照すべてバイオインフォマティクス ONDRI の目的のための処理が実行されます。 参照ゲノム配列読み取りにマップします。 構成する場合、バイオインフォマティクスの手順をすべての使用は、同じ参照ゲノムをあることを確認、必要に応じて参照ゲノムを選択します。 ドロップ ダウン リストはマスキング モードから、リファレンス ・ シーケンスの領域はマスクしないように「マスキングなし」を選択します。 既定のソフトウェアによって割り当てられたオプションのマッピングを使用します。研究の目的に基づく製造元の指示24これが許容できることを確認を確認します。 任意の読み取りマッピング エラー、特に周囲の挿入・削除の亜種を解決する人間の参照ゲノムにワークフローのローカル再編であります。 ソフトウェアによって割り当てられた既定のローカル再編成オプションを使用します。研究の目的に基づく製造元の指示24これが許容できることを確認を確認します。 誤25が生じる PCR 増幅バイアスの影響を低減する NGS プロトコル内で PCR によって生成される重複割り当てられた読み取りを削除します。 「最大の表現少数シーケンス (%)」、研究のニーズに基づいてを設定します。注: 寛大な設定 ONDRISeq のために使用されるので、5%;ただし、ソフトウェアの既定の設定より厳格な 20% です。2 回の読み取りが非常に類似しているより少ない読み取り数のシーケンスを PCR 増幅バイアスからのシーケンス エラーと見なす必要があるかどうかはこの設定が決定します。したがって、設定 5%、少数派は、カウントの大半の ≤ 5% 読み取るカウントを読む大半に同じように修正する必要がありますを読みます。 4.3.3 の手順で生成された読み取りトラックからカバレッジの概要テキスト ファイルの形式でターゲット地域の統計情報をエクスポートします。非特異的と設定で壊れたペアを無視します。これらのファイルをローカル ドライブにコピー先を選択します。 4.3.3 の手順で生成された読み取りトラックから各サンプルのバイナリ シーケンスの配置マップ (BAM) ファイルをエクスポートします。分析を将来的に必要な場合、シーケンスの位置合わせデータが含まれます。これらのファイルをローカル ドライブにコピー先を選択します。 バリアント検出シーケンス内のバリアントを呼び出すためのメソッドを選択します。メモ: サンプルの倍数性についての仮定を作ることがとき、固定倍数バリアント検出アルゴリズムが使用する、ONDRISeq の目的のため使用をお勧めします。この仮定できない場合は、製造元の指示24研究の目的に最適なアルゴリズムを判断するを参照してください。 設定する場合、固定の倍数からバリアント型パラメーター オプションの倍数性に適切な設定サンプル生物。「必要なバリアント確率」または 90.0% で、保持するためにバリアントが正しく呼び出されたこと確率を設定します。 次の一般的なフィルターの設定使用: 最小の「カバレッジ」10「最小数」が 2 倍、「読み取り」に基づいた非特異的な一致を無視 20%、「無視するペアを分割」、「最小読み取り周波数」と「最小読み取りの長さ”20 の。注: これらのパラメーターは、ONDRISeq の目的に基づいています。製造元の指示24行われている研究のために適切であることを確認するを参照してください。 次のノイズ フィルターの設定使用: 品質スコア 5、「最小中央品質」20 のスコアと 15; の「最小近所品質」マッピング スコアをマッピングのマッピング「の近所半径」と「品質のフィルターの基本」5.0% の「読み方向フィルター」1.0% の意義の「相対読み取り方向フィルター」。注: これらのパラメーターは、ONDRISeq の目的に基づいています。製造元の指示24行われている研究のために適切であることを確認するを参照してください。 対象となるパネルの対象地域として指定したブラウザー拡張データ (ベッド) ファイルでターゲットを絞った NGS パネル選択ゲノム領域内で発生する変形だけを許可すると、重複に基づくと呼ばれているバリエーションをフィルターします。保持されます。注: ベッド ファイルはパネルをカバーすることができるゲノムの領域に基づいて利用されているターゲットの NGS パネルに一意になります。 4.3.7 以降の手順で作成したバリアントのトラックからバリアントの呼び出し形式 (VCF) ファイルでバリアント レポートをエクスポートします。これらのファイルをローカル ドライブにコピー先を選択します。 ソフトウェアの「ツールボックス」で使用できるように24製造元の指示に従いワークフローをインストールして保存します。ワークフローの名前は、それが、将来的に明確な NGS パネルに適しています。 インストール中に「エクスポート参照データ」オプション] ダイアログ ボックスで「バンドル」すべてオプションを設定します。 インストール時に「インストール先」オプションのダイアログ ボックスで、”ローカル コンピューターに、ワークフローをインストールする」をクリックしてします。 4.3 の手順で設計されたカスタマイズされたバイオインフォマティクス ワークフローを通じて24の製造元の指示に従ってファイルを読み取りする FASTQ シーケンスのインポートを実行します。 ソフトウェアの「ツールボックス」の手順 4.3 設計ワークフローを識別し、それをダブルクリックします。 ダイアログ ボックスが表示されますが、「ナビゲーション領域」内の 4.2 のステップでインポートされた FASTQ ファイルのフォルダーを探します。「ナビゲーション領域」内で選択することによってすべてのフォルダーを強調表示し、「バッチ」の横にあるボックスをクリックします。「要素の選択」ファイルを移動するには、右向き矢印を使用します。ダイアログ ボックスの下部で、「次へ」をクリックします。 「バッチの概要」を確認] ダイアログ ボックス内で選択された正しい FASTQ ファイルことを確認し、「次へ」をクリックしますします。 正しいファイルを確実して場所をエクスポートするには、ダイアログ ボックス内のワークフローの次の手順は手順 4.3 でワークフローを設計するとき選択されたレビュー: 地図を読み取りに「参照」;重複した割り当てられた読み取りを削除する”;「対象地域の統計を作成する」;「BAM をエクスポート」;「[エクスポート] タブ区切りテキスト」。「重複に基づくフィルター」;「VCF の輸出」と ダイアログ ボックスの最後のステップの内で-「処理結果」- オプションを選択して”フォルダーに保存入力」。ダイアログ ボックスの下部に [完了] をクリックします。注: 各サンプルのファイルが生成されることを意味は、処理前のソフトウェア データ内 FASTQ ファイルが格納されるフォルダーに配置されます。 図 2: 処理前の ONDRISeq の目的のためにカスタマイズされたソフトウェア (材料表) データ内ファイルの順序や FASTQ のバリアントを呼び出すワークフロー 。ワークフローの手順は、他の NGS の順序に適用できるし、研究者のニーズに基づいて呼び出しソフトウェア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 5. バリアント注釈 ダウンロードして、各サンプルの VCF ファイルにバリアントの注釈を実行する注釈を付ける変化 (ANNOVAR)26スクリプトをカスタマイズします。 注釈として含まれる ANNOVAR から次のデータベースをダウンロード: 1) RefSeq27 (2015 年 8 月更新)2) dbSNP13828 (2014 年 9 月更新)3) エキソーム集計コンソーシアム29 (負荷インピー ダンス、バージョン 0.3 2015 年 11 月更新)。4)、国民の中心、肺および血の所エキソーム配列プロジェクト欧州コホート30 (ESP、2015 年 3 月更新)5) 1000 ゲノム プロジェクト欧州コホート31 (1KGP、2015 年 8 月更新)6) ClinVar32 (2016 年 3 月更新)・ 7) 注釈を組み合わせる依存枯渇33 (CADD) 耐性34から偏狭な並べ替え (ふるいにかける), と PolyPhen 235。注: ゲノムを調整し、人間のゲノムのビルド GRCh37/hg19 呼ばれる ANNOVAR によって参照されるすべてのデータベース。また、記載されているデータベースのバージョンが利用可能な最新のバージョンを使用して、データベースのダウンロード時に ONDRISeq のために使用されたものであります。 に応じて、カスタマイズする注釈付きの亜種としてを使用して注釈付きの亜種の減らされたコンパイルの完全なリストを出力する ANNOVAR–フィルター操作26。注: リストは、研究者のニーズに基づいてカスタマイズできます。最寄りのエクソンから 15 拠点よりもさらに発生する変形またはマイナーアレル頻度 (MAF) 任意のバリアント ONDRISeq のために、注釈付きの亜種のリストは含みません > 3 つのデータベースのいずれかで 3%: 1) 負荷インピー ダンス;2) ESP;・ 3) 1KGP。この手順の使用を強くお勧めします。 必要な場合は、研究者26のニーズに基づいて特定の対立遺伝子の呼び出しを 1 つに ANNOVAR をカスタマイズします。注: ONDRISeq では、ANNOVAR 評価アポリスク対立遺伝子 rs429358 のシーケンスの呼び出し (C > T):p.C130R と rs7412 (C > 可能な 6 がある全体的なアポの遺伝子型を出力するために T):p.R176Cなど、組み合わせ: 1) E2/E2;2) E3/E2;3) E4/E2;4) E3/E3;5) E4/E3;6) E4/E4。これらの 6 可能なAPOE遺伝子の E4/E4 は晩発性アルツハイマー病36を開発するための最も一般に受け入れられた遺伝的危険因子です。 病突然変異データベースの亜種が合理的な証拠を伴う疾患に以前関連付けられているかどうかは、(テーブルの材料) を照会します。以前は新規バリアントとして報告されていない任意のバリエーションを検討します。 ClinVar から ANNOVAR の注釈を評価、任意分類可能性が高い病原性または病原性疾患に関連する変形を含めるようにします。 インシリコ予測を通じてスプライシングバリアント プロセス ツール解析の亜種の接続ベース37 (SPANR) と人間のスプライシング ファインダー38 (HSF、バージョン 3.0)。 サンプルの大規模な数を処理している場合は、どのバリエーションは様々 なサンプルによって共有されるを決定する各サンプル内バリアントの呼び出しを比較します。手動でまたはシーケンス可能な成果物と汚染のでき事の検出を可能にするカスタム設計されたスクリプトでは、これを行います。注: ONDRI のために、カスタム スクリプトを互いに比較することによって ANNOVAR の出力ファイルに注釈を付ける使用です。スクリプトには、変異は、そうでなければ研究コホートにおけるバリアントの歴史と呼ばれる、同じバリエーションをかくまっているその他のサンプルのサブジェクト ID あたり、注釈が組み込まれています。 アメリカの大学遺伝医学 (ACMG) 病原性のガイドライン39、割り当てる各バリエーションとして、次のいずれかの分類に基づくバリエーションの分類: 1) 病原性;2) 可能性が高い病原性;3) 不確かな意義がある; のバリアント4) おそらく良性。または 5) 良性。メモ: ONDRI のため、社内の設計された Python スクリプトは、半自動化されたに基づいて ACMG 分類を実行する使用されます。この研究のため使用していませんが、インターバル ・40は類似した方法で利用することができます同様に設計されたツールです。 サンガー シーケンスのシーケンスの範囲で任意のバリアント < 30 x および/または彼らはないアーティファクト41をシーケンス処理を検証する研究コホートの > 10% で確認されている亜種。