JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Выделение и характеристика сердечной мезенхимальных стромальных клеток от эндомиокардиальная относящийся к биопсии образцы больных аритмогенная кардиомиопатия

Published: February 28, 2018
doi:
10.3791/57263
, , , , , , , , , ,
1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health,Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

Summary

В этой статье предоставляется метод, чтобы изолировать сердца Мезенхимальные стромальные клетки от эндомиокардиальная относящийся к биопсии образцов аритмогенная кардиомиопатия больных. Их характеристика и протокол для повышения их дифференциации адипогенном описаны.

Abstract

Нормальный Взрослый сердце состоит из нескольких различных типов клеток, среди которых сердца Мезенхимальные стромальные клетки представляют собой обильные населения. Изоляция этих клеток предлагает возможность изучения их участие в сердечных заболеваний и, Кроме того, предоставляет полезные главной ячейки модель для изучения биологических механизмов.

Здесь описан метод для изоляции C-MSC от аритмогенная кардиомиопатия пациентов относящийся к биопсии образцов. В правого желудочка районах, прилегающих к шрам визуализированное электро анатомические сопоставления руководствуется эндомиокардиальная биопсия выборки. Описан пищеварение биопсий коллагеназы и их покрытие на пластиковых блюдо в питательной среды позволяют C-MSC роста. Изолированных клеток может быть расширена в культуре за несколько проходов. Для подтверждения их мезенхимальных фенотип, приводится описание иммуно фенотипические характеристики. C-MSC способны дифференцироваться в нескольких типов клеток как адипоциты, хондроцитов и остеобластов: в контексте ACM, характеризуется Адипоцит вкладов в сердцах пациентов, протоколы для дифференциации адипогенном C-MSC и характеристика накопления липидов капелька описаны.

Introduction

Мезенхимальные стромальные клетки (MSC) являются взрослые клетки с важную вспомогательную функцию многих тканей1. Костный мозг представляет собой исторический источник MSC, но они могут быть изолированы от различных тканей, включая плаценту, жировой ткани, пуповинной крови, печени и сердца1,2.

В 2006 году международное общество для клеточной терапии (ИКСТ) указан, в первый раз, минимальные критерии для определения человека МСЦ3. В частности MSC должен иметь возможность придерживаться пластика. Они выражают конкретные поверхностных антигенов: позитивность для CD44, CD105, CD29 и CD90 мезенхимальных маркеры и отрицательность CD14, CD45, CD34, CD31 кроветворные и эндотелиальных маркеры характеризуют MSC. Из-за отсутствия выражение HLA-DR MSC способны вызвать alloreactivity. Кроме того они являются Multipotent с клетки с потенциалом для дифференцировать адипогенном, хондроцитов и остеобластов линий1,3.

Сосредоточение внимания на сердца клеточный состав, сердечной Мезенхимальные стромальные клетки (C-MSC) обильные в нормальный Взрослый сердце4,5. Они играют критически важную роль в нормальной функции сердца и патологических состояний. Хотя, физиологически, C-MSC обеспечивают микроокружения, поддерживающий структурной и функциональной целостности миокарда, заболеваний сердца они активируются в ответ на травмы сердца, участвующих в заживлении ран и фиброзных ремоделирования6 ,7.

Недавно участие C-MSC в аритмогенная кардиомиопатия (ACM) жировой замены был продемонстрировали8. В частности ACM является генетическим расстройством, главным образом, вызванных мутациями в desmosomal гены, которые приводят к миокарда замена фиброзно жирные, главным образом в правый желудочек9. Эта замена, простирается от epicardium до эндокарда, создает непроводящих субстрат, который вызывает прогрессивные сердечной недостаточности и ухудшает желудочковых аритмий, которые могут привести, в тяжелых случаях, к внезапной смерти. Sommariva и др. продемонстрировал мезенхимальных происхождение предварительно адипоцитов в разделах описаны сердце ACM пациентов. Кроме того C-MSC изолированы от эндомиокардиальных биопсий ACM сердца Экспресс desmosomal генов и поэтому могут быть затронуты их мутаций. В частности в адипогенном условиях, ACM C-MSC накопить больше липиды, чем те, от управления сердец. Это доказательство приводит к выводу, что C-MSC так играли активную роль в патогенезе заболевания и представляют действительный ячеечная модель для изучения ACM.

Для облегчения будущих исследований в этом контексте или других сердечных заболеваний, для которых указан биопсия сердечной, представлен подробный протокол для изоляции C-MSC от небольших фрагментов эндомиокардиальная ткани, их расширение, их иммуно фенотипические Характеристика и адипогенном дифференциации.

Protocol

Этот подход соответствует Хельсинкской декларации и правого желудочка проб был одобрен «Centro Cardiologico Monzino IRCCS» Комитета по этике (07/06/2012). 1. решения Сделать TMES средством для C-MSC культуры с Iscove на изменение Дульбекко среднего (IMDM), дополнены 20% плода Bovine сыворотки (ФБС), фактор роста фибробластов основные 10 нг/мл, 10 000 ед/мл пенициллин, 10 000 мкг/мл стрептомицина и 0,02 М L-глютамина. Фильтр TMES среды с помощью стерильного фильтра 0.22 мкм и хранить при 4 ° C. Подготовить раствор коллагеназы, Ресуспензируйте коллагеназы NB4 смесь в IMDM среде для получения окончательного решения с концентрацией 3 мг/мл. Вихрь осторожно, чтобы растворить порошок и фильтровать коллагеназы решения с помощью шприца фильтра 0,2 мкм. Объем аликвота 1 мл 2 мл стерильные трубы и хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется для использования. Подготовить ADIPO т. средний, сделать адипогенном средний с IMDM среднего дополнена 10% FBS, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (предварительно разводят в диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 0,5 М и хранятся при температуре-20 ° C до использования), гидрокортизон 1 мкм (предварительно разбавленный в ДМСО в 100 мм и далее разбавляют до 10 мм в стерильной дистиллированной воде и хранятся при температуре-20 ° C до использования) и индометацин 0,1 мм (предварительно разводят в ДМСО в концентрации 0,5 М и хранятся при температуре-20 ° C до использования). Фильтр т. ADIPO среды с помощью 0,22 мкм стерильным фильтром и хранить при 4 ° C. Подготовить Отмывающий буфер, состоящий из фосфат амортизированное saline 0.0067 М PO4 (PBS), Этилендиамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА), 5 мм и 5% бычьего сывороточного альбумина и хранить при 4 ° C. Подготовьте масло красный O (Оро) рабочий раствор путем растворения порошка Оро 1% в 60% изопропиловый спирт, смешивая 2 h и фильтрации с помощью 0,22 мкм фильтр для удаления осадка. Сохраните рабочий раствор при комнатной температуре (RT). 2. изоляция сердечной мезенхимальных стромальных клеток Биопсия сердечной сбор и обработкаПримечание: перед началом, убедитесь, что решение коллагеназы и среднего TMES готов. Положите в ACM эндомиокардиальная биопсия (обычно около 5 мг ткани) в стерильную пробирку заполнены с TMES и транспортировать его в лабораторию.Примечание: ACM биопсий собираются в операционной комнате электрофизиологии, по данным предыдущих докладов10. Вкратце, интеграция электро анатомические сопоставления и внутрисердечной эхокардиографии в правом желудочке (см. видео 1) используется для руководства эндомиокардиальная биопсия (см 2 видео, рентгеноскопии) в корреспонденции к пограничной зоне больной миокарда. Здорового управления (HC) образцы поставляются ткани био-банком, полученные из правого желудочка свободной стенки трупных доноров в течение 24 ч смерти (случайная смерть, здоровых испытуемых). Во время транспортировки и до вскрытия Храните биопсии в TMES на 4 ° C. Ограничьте время между биопсии сбора и обработки тканей (Макс. 24 h). Настройка биологической безопасности кабинета с необходимые решения для выполнения процедуры до ферментативного пищеварения. Поставьте стерилизатор под капотом и поверните на 15 минут перед использованием инструмента до тех пор, пока температура поднимается 200-250 ° C. Стерилизовать ножницы и щипчики для 10 s. Make уверен стерилизованные инструменты холодной перед использованием. Подготовьте Стерильные одноразовые скальпели. Место труб с биопсией в стерильных Худ. Откройте трубки и передачи биопсии в стерильных плиту. Вымойте правый желудочек биопсии дважды с 3 мл стерильного PBS. Если вы хотите сделайте снимок биопсии в Микроскоп. Передача в правый желудочек биопсия, с использованием стерильных пинцетов, в стерильных 2-мл пробирку, содержащую 1 мл раствора коллагеназы. Нарежьте образца 0,5 – 1 мм3 стерильными ножницами. Проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C под непрерывной ротации агитации. Центрифуга переваривается решение на 400 g x 10 мин на RT. Удалить супернатант и добавить 1 мл стерильного PBS чтобы помыть лепешка. Центрифуга на 400 x g 10 мин на RT. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл TMES среды. Пластина полученные подвеска на стерильную культуры ткани 60-мм лечение пластину и добавить средне TMES окончательный объем 3 мл. Инкубируйте пластину в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2.Примечание: Больший объем среднего может помешать правильно адгезии переваривается биопсии фрагментов. После 24 часов отбросить средство для удаления не сторонник клетки и мусора.Примечание: Одноместный диссоциированных Мезенхимальные клетки можно прикрепить к пластиковой поверхности и порождают клоны; Кроме того непереваренных биопсии малых фрагментов можно прикрепить на пластиковые блюдо и позволяют клеток прорастания. Вымойте тарелку дважды с 5 мл стерильной PBS и добавить 3 мл свежего TMES среды. Замените TMES средний, три раза в неделю до тех пор, пока клетки являются 80% притока.Примечание: Количество вложенных клеток зависит от качества, количество ткани и на эффективности пищеварения. 3. клетки расширение Примечание: Перед началом убедитесь, что у среднего TMES готов. Когда клетки являются 80% вырожденная, передачи переваривается небольшие относящийся к биопсии образцы в новую стерильную культуру ткани 60-мм лечение плиты и добавить 3 мл свежего TMES среды.Примечание: Относящийся к биопсии образцы могут быть повторно использованы для дальнейшей изоляции C-MSC. Это можно повторять эту процедуру до тех пор, пока существует значительное число изолированных клеток. Вымойте прилагаемый клетки дважды с 3 мл стерильного PBS. Добавить раствор трипсина ЭДТА (0,5 мл для блюдо 60-мм) и инкубировать при 37 ° C для 3-5 мин позволить мобильный отряд. Когда клетки отсоединены от поверхности плиты, добавьте 0,5 мл стерильного FBS инактивирует трипсина и собрать клетки в новой 50 мл стерильной пробирке. Вымойте тарелку дважды с 5 мл стерильной PBS чтобы добавить оставшиеся ячейки же трубку. Центрифуга клетки на 400 g x 10 мин на RT. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл TMES среды. Загрузите 10 мкл суспензии клеток в ячейке, считая камеры.Примечание: Если клетки слишком сконцентрированы, разбавьте 1:10 первоначальных подвеска в PBS и загрузить 10 мкл разбавленного клеток в ячейке, считая камеры. Под микроскопом подсчитать количество ячеек в 3 больших площадей и по линии двух из их сторон и вычислить среднее количество клеток.Примечание: Чтобы получить количество клеток/мл, среднее значение Подсчет ячеек умножается на 104, коэффициент разбавления ячейки подсчета камеры. Если клетки были дополнительно разрежается, умножьте на коэффициент разрежения. Соотношение между числом ячеек для семян и концентрации клеток (количество клеток/мл) соответствует объему (в мл) первоначального Подвесные покрытием для следующего шага (пункт 3.9). Пластина ресуспендирования на стерильную 100-мм тканевой культуры рассматриваются пластин в конечной концентрации 5000-10 000 клеток/см2 и добавить средне TMES окончательный объем 8 мл. Инкубируйте пластины в инкубатор культуры клеток.Примечание: Повторите процедуру расширения клетки, клетки при 70-80% притока. На каждый проход (P) рекомендуется для криоконсервации часть клеток и пластины оставшаяся сумма. Разверните клетки до P3 или P4 и использовать для анализа сортировщик (FACS) активирована люминесцентные клеток (раздел 4) и адипогенном дифференциации (раздел 5). Для криоконсервации после отсоединения центрифуга клетки на 400 g x 10 мин на RT. Подсчет количества ячеек, как описано (шаги 3,7-3,8) и Ресуспензируйте 1 х 106 клеток в 900 мкл стерильных FBS. Трансфер в стерильных крио флакон и 100 мкл стерильных ДМСО и перемешать. Быстро хранить крио флаконов в контейнер замораживания при температуре-80 ° C в течение 2 дней, а затем передать флаконов в жидкий азот. 4. характеристика сердечной мезенхимальных стромальных клеток в проточной цитометрии Примечание: Перед началом, убедитесь, что у клеток диссоциации реагента, Стиральная буфер и специфических антител в подготовленных. Когда номер ячейки достигает по меньшей мере 3 х 106 (количество ячеек, как описано в 3,7-3,8), мыть 100-мм пластины дважды с 10 мл стерильной PBS. Добавьте 5 мл реагента диссоциации клеток и ждать 7-10 мин на RT, чтобы позволить мобильный отряд. Когда клетки отсоединены от поверхности пластины, добавляют 15 мл стерильного Отмывающий буфер и собирать подвеска в новой 50 мл стерильной пробирке. Вымойте тарелку дважды с 10 мл отмывающего буфера и добавить оставшиеся ячейки же трубку. Центрифуга клетки на 400 g x 10 мин на RT и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл отмывающего буфера. Подсчитать ячейки как описано (шаги 3,7-3,8) и передачи 3 х 106 клеток в новую стерильную пробирку и добавьте Отмывающий буфер окончательный объем 1,5 мл.Примечание: Ячейке число и общий объем Отмывающий буфер зависит от количества выбранных маркеров, используемые для анализа (3 x 105 клеток в 100 мкл для каждой трубы из полистирола FACS). Распространение 100 мкл сотовых подвеска в 12 различных СУИМ полистирола трубы и добавьте специфическое антитело в концентрации, указанные в описании продукта.Примечание: Антитела используются для C-MSC характеристика являются CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 и HLA-DR (Таблица 1). Важно подготовить образец управления, состоящий из 100 мкл ресуспензированы клеток, окрашенных с изотипа контроля для проверки специфика сигнала. Проинкубируйте образцы для 15 мин в темноте. Добавьте 1 мл стерильного Отмывающий буфер в каждую пробирку, чтобы остановить реакции. Центрифуга клетки на 400 g x 10 мин на RT. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл отмывающего буфера. Перейти к C-MSC характеристика с проточной цитометрии. 5. адипогенном дифференцировка сердца мезенхимальных стромальных клеток Примечание: Перед началом, убедитесь, что подготовили т. ADIPO среднего и Оро рабочего раствора. Культура в среде ADIPO т. Отсоединение и подсчет количества ячеек, как описано в разделе 3. Пластина 3 x 105 клеток на каждой скважине стерильные культуры ткани 6-хорошо лечить пластины в 2 мл т. ADIPO среды. Пусть C-MSC дифференцировать в среде ADIPO т. за 72 ч или 1 недели, изменения среднего каждые 2-3 дня. Пятнать Красного O нефтиПримечание: использования нефти красный O (Оро) пятная проверить накопление липидов в C-MSC. Место plateunder 6-ну культуры ткани зонта. Удалите средство адипогенном и вымыть клетки дважды с 2 мл ФСБ. Добавьте достаточно объем параформальдегида 4% (PFA) для покрытия каждый хорошо. Исправить ячейки для 5 мин на RT. Отменить PFA и вымыть клетки дважды с 2 мл ФСБ. Инкубировать фиксированные ячейки с Оро рабочего раствора 1 h на RT, используя достаточный объем для покрытия каждый хорошо.Примечание: Не держите пластину 6-ну тканевые культуры под зонт во время инкубации ORO Чтобы избежать испарения Оро рабочего раствора. Удалите все Оро рабочего раствора и промыть 2 мл PBS 3 – 5 раз, до тех пор, пока пластины полностью очищается; отказаться от стирок. Остановите стирок, когда используется PBS ясно и вы не видите, под микроскопом, неспецифическая окрашивания из клетки. 20 снимков при 20-кратном для каждой скважины с помощью микроскопа фазово контрастной Перевернутый культуры ткани. Откройте изображения с программой обработки изображений для количественного определения Оро накопления клеток. Отделить различные цветовые каналы через функцию «разделить каналы» для того, чтобы подсчитать только яркости в 255-красный канал. Подсчитать количество ячеек для каждого изображения путем подсчета ядер. Нормализовать Оро интенсивности сигнала на номер ячейки. Вычислить среднее значение результатов, полученных для каждой картины того же образца.

Representative Results

Сердца стромальные клетки изоляции: C-MSC изоляции от эндомиокардиальная биопсия процедура приводится на рисунке 1. Сердца стромальные клетки мезенхимальных характеристика: Как установлено международным обществом клеточной терапии (ИКСТ), минимальные критерии для определения Multipotent с Мезенхимальные стромальные клетки включает их иммуно фенотипические характеристики3. В частности для подтверждения их мезенхимальных линии, клетки инкубировали с соответствующим FITC/PE/APC-конъюгированных антител и проанализированы проточной цитометрии. Все антитела, которые используются в C-MSC характеристике, перечислены в Таблице материалов. Как показано на рисунке 2, C-MSC, полученные от биопсии положительные для конкретных мезенхимальных поверхностных антигенов CD29, CD44 и CD105. Процент положительных клеток CD90 является переменной, как ранее сообщалось11. Эндотелия (CD31, CD34), моноцитов/макрофагов (CD14), кроветворные маркеров (CD45) и комплекс гистосовместимости (HLA-DR) не являются выразил (рис. 2). Дифференциация адипогенном Мезенхимальные стромальные клетки сердца: Чтобы запрашивать их адипогенном дифференциации, C-MSC, полученных от пациентов, пострадавших от ACM и HC должны быть культивировали в среде ADIPO т. (см. раздел решения). Клетки поддерживаются в культуре для 72 ч или 1 неделя, заменив среднего два раза в неделю. Накоплению внутриклеточного липидного капель подтверждается Оро, окрашивание (рис. 3). Различия в способности, а также в степени дифференцировки, может наблюдаться между клеток, полученных из ACM и HC. Как показано на рисунках представитель, ACM C-MSC накапливается больше капелек липидов чем HC C-MSC после 72 ч культуры в адипогенном среднего (рис. 3). Эти различия также поддерживаются, когда клетки подвергаются воздействию адипогенном дифференциации условий для более длительного периода (1 неделя) (рис. 3). Видео 1: Интеграция электроанатомического карта и внутрисердечной эхокардиографии. Эндокарда однополярного электроанатомического карты правого желудочка (левой передней косые и правой передней наклонной просмотров) в пациента, который подвергается эндомиокардиальная биопсия (нижняя панели). Ограниченные участки низкого напряжения (красный/зеленый) видны на вершине. Эндомиокардиальная относящийся к биопсии (помеченный как круг) образцов в переписке для больных сердечной мышцы и межжелудочковой перегородки. Реальном времени внутрисердечной эхокардиографии позволяет проверить правильное положение bioptome в районе цели (верхняя группа). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.) Видео 2: рентгеноскопия видео в правой передней косой взгляд. Bioptome вставляется через Лонг мощность оболочка и передовых в желудочек. После тщательной проверки bioptome контакта с миокарда челюсти открыты и затем прочно закрыт для собирать образца. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.) Рисунок 1: проект процедуры. Относящийся к биопсии образца эндомиокардиальная собираются с использованием bioptome катетер, маленький клещи образный режущего инструмента. Вес полученного биопсии составляет приблизительно 5 мг (A). Относящийся к биопсии образца эндомиокардиальная фарша в 0,5 – 1 мм3 фрагментов, с стерильными ножницами (B), и коллагеназы решение добавляется. Образец помещается в инкубаторе 37 ° C на вращающейся платформе смеситель для 1,5 h пищеварения (C). Усваивается раствор центрифугировали и покрытием в TMES в пластиковый блюдо (D). C-MSC получаются благодаря их свойства пластиковых присоединения либо в отдельные ячейки или клоны, прорастание из небольших фрагментов непереваренных относящийся к биопсии (E). C-MSC затем характеризуются проточной цитометрии (F). C-MSC покрыты в адипогенном среднего и накопление липидов капелька проверяется нефти O красное окрашивание (G). Шкала индикатора указывают 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: представитель Цито Флуориметрическое профиль C-MSC. Каждый Гистограмма показывает количество клеток против интенсивности флуоресценции в указанный канал (PE: фикоэритрин; APC: аллофикоцианин; FITC: флуоресцеин isothyocyanate). В каждой графе изотипа управления (белый) и образец конъюгированных с конкретной ячейкой приведены поверхности маркер антитела (красный). C-MSC являются позитивными для мезенхимальных поверхностных антигенов CD29, CD44, CD105 и, частично, CD90, тогда как они не выражают CD31, CD34, CD14, CD45 и HLA-доктор пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: адипогенном дифференциация C-MSC. Представитель изображения ACM и HC C-MSC, культивируемых в адипогенном среднего за 72 ч и 1 неделю, окрашенных с Оро (левого изображения; n = 3). На правом графике, сообщается количественного определения яркости 255-красный канал окрашивания: интенсивность выражается в произвольных единицах (а.е.). ACM C-MSC накопить больше капелек липидов чем элементы управления. T-критерия Стьюдента используется, *: p < 0,05. Шкала индикатора указывают 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

MSC и C-MSC: MSC являются Multipotent с клетки проживающих в стромальные долю различных взрослых тканях, таких как костного, жировой ткани, хрящей, мозга, кожи, плода приложения и сердце12. Различные исследования были проведены для изоляции и характеризуют их потенциальных приложений в базовых и трансляционного исследования12,13.

В здоровых условиях MSC покоя, самостоятельного обновления недорого14. Так как они подвергаются воздействию патологических изменений в окружающей среде, они реагируют, укрепление тканей ремоделирования по через прямой transdifferentiation, матрицы осаждения или эффект паракринными14.

Сердца MSC (C-MSC) представляют собой большие номера myocyte популяции клеток сердца4. Они происходят из epicardium и мигрируют в миокарде в процессе переходного эпителия в мезенхимальных15. Они способствуют механические и электрические целостности структуры сердца, физиологических и патологических состояниях, через взаимодействие с кардиомиоцитов и внеклеточного матрикса гомеостаза7,16. Однако до сих пор не полностью понимается широкий спектр C-MSC функций. Более глубокие знания об их роли, которую как в физиологических и патологических условиях может быть облегчено в vitro исследования выполнены после их изоляции.

C-MSC были получены из различных районов человеческого сердца, например предсердий придаток2,17 и18правый желудочек.

Недавно C-MSC от человека правого желудочка эндомиокардиальная относящийся к биопсии образцы были получены8, демонстрируя, что источник ткани может быть всего лишь 3-5 мг.

Возможные применения: Метод конспектированный в этой рукописи позволяет получить клетки с несколько простых пассажи, как пищеварение и выделение для пластиковых присоединения, от очень маленькие сердца образцов.

C-MSC можно считать ячеечная модель, так как они легко усиливать и поддерживать в пробиркеи способны дифференцироваться в клетки mesenchymal линии (эндотелий, остеоциты и адипоцитов). Кроме того возможность получения непосредственно от больных клеток представляет собой большой в vitro инструмент механистический исследований в контексте персонализированные/точность медицины. Действительно эти клетки несут генетический фон и в конечном итоге специфических мутаций доноров и находятся под влиянием конкретных больных характеристики, такие как клинических условий, возраста, пола, образ жизни и лекарства. Кроме того возможность сортировки их для различных маркеров может разрешить исследования конкретных подмножеств C-MSC19.

Известно, что C-MSC быть активными игроками в различных сердечно-сосудистых заболеваний, главным образом характерны неблагоприятные Ремоделирование сердца. Таким образом они представляют собой цели кандидат для роман терапевтических стратегий по борьбе с заболеваниями сердца8,20.

C-MSC стволовых как свойства и их отсутствие значительных иммуногенности предлагает возможности их применения в клеточной терапии сердечной восстановительной медицины. Действительно как MSC из костного мозга или других источников, C-MSC могут потенциально использоваться аутологичных и аллогенных параметров, без необходимости для сопоставления между донорами и получателями помощи21.

Кроме того C-MSC, будучи изолирован непосредственно из ткани сердца, имеют преимущество выдержано сердца микро среды и эпигеномные профиль. В контексте сердечной регенеративной медицины это может быть особенно важно для получения успешных результатов.

На сегодняшний день, доклинические исследования регенеративной медицины определены полезные терапевтический потенциал в C-MSC и их паракринными деятельность18,22,23. Важно то, что клинические испытания, в которых клетки источник является сердцем ведутся с cardiosfere производные клеток или субпопуляций C-MSC13,24,25. Однако что касается кости-костного мозга производные MSC, различные протоколы могут потребоваться для получения клинических класс C-MSC26.

C-MSC в ACM: Представленные протокол в основном подходит для изучения патологии, для которых указан эндокарда биопсии. ACM пациенты проходят относящийся к биопсии процедур для диагностических целей27. Их миокарда постепенно заменяется рубцовой ткани, электрически инертным ткани, состоящий из адипоцитов и фиброза. Для руководства относящийся к биопсии выборки области шрам, где диагностический выход максимальна, эндомиокардиальная сопоставление будет использовано10,28,29. В пограничной зоне больных сердечной мышцы берутся образцы, используемые в настоящем Протоколе.

Sommariva et al. недавно определил ключевую роль C-MSC в патогенезе ACM8, демонстрируя, что C-MSC являются активными игроками в ACM adipogenesis сердца, поскольку preadipocytes в сердцах этих мезенхимальных происхождения. Кроме того C-MSC изолированных с настоящего Протокола от ACM пациентов биопсий, показал более склонность к накоплению липидов и adipogenesis чем элементы управления. По этой причине эти клетки могут использоваться для подтверждения некоторых молекулярных механизмов ACM, доказывая их пригодность в качестве ячеечная модель для механистический исследования9.

Ограничений и критических шагов: Несмотря на преимущества получения C-MSC непосредственно от больных (см. пункт «Возможные приложения») этот протокол подвергается различные ограничения.

Во-первых, процедура сердечной относящийся к биопсии инвазивных и часто избежать, если не строго необходимо. Действительно выборка сердечной ткани является этически и технически проблематичным. Причины для выполнения биопсии сердца может быть достижение окончательного диагноза в контексте кардиомиопатии в дифференциальной диагностики, мониторинга состояния сердечной трансплантации, или выяснения наличия опухоли сердца30. Таким образом могут быть зачислены только пациентов, для которых эндомиокардиальная биопсия указывается путем консенсуса заявление31 для исследований на C-MSC. Кроме того сердечной относящийся к биопсии процедура может иметь клиническое осложнений, прежде всего в сердцах cardiomyopathic. Таким образом сэмплинг электрофизиологом всегда осторожный и относящийся к биопсии образцов может быть очень маленьким, ущерба для изоляции клеток. Будущие эксперименты могут преодолеть эту проблему тюнинг коллагеназы концентрации или сроков пищеварения.

C-MSC, как всех первичных клеток человека, показать высокой изменчивости среди различных субъектов в всех фенотипов. Действительно клетки из разных предметов не только генетически различные, но также подвергли к переменной экологической принадлежности. В частности в рамках этого эксперимента, наблюдается высокая изменчивость в изоляции, роста и адипогенном дифференцировки клеток.

Важнейшие шаги настоящего Протокола должны быть признаны. Если относящийся к биопсии образца включает капилляров, они должны быть удалены, чтобы избежать параллельного изоляции эндотелиальных клеток, которые могут загрязнить C-MSC культуры и может быть подтверждено анализ СУИМ (позитивность для CD31). Чтобы получить эффективное адипогенном дифференциации, клетки должны быть в фазе активного роста. Степень слияния могут также влиять накопление липидов.

Значение метода: Что касается предыдущих методов изоляции мезенхимальных стромальных клеток это первый раз, где предлагается описание C-MSC получения непосредственно от человека желудочков относящийся к биопсии образцов в деталях. Хотя этот метод предлагается для обработки ACM пациентов образцов, это потенциально применимых для всех пациентов, для которых указан биопсия сердца.

Этот протокол представляет собой полезную реализацию предыдущих методов для получения клеток, которые требуют больше сердца образцы32, которые часто трудно собрать.

Кроме того образец исходного кода, является интересным новшеством. Хотя желудочков биопсия обычно выполняется на перегородки33, этот протокол принимает во внимание образцы, полученные из правого желудочка свободный стены. Клетки, полученные из района больной правого желудочка может быть более представительным патологического состояния заболеваниях, сопровождающихся RV.

Кроме того некоторые из реагентов, используемых в настоящем Протоколе отличаются в отношении других C-MSC изоляции и дифференциация методов32. Например, тип коллагеназы, предложенные в этой рукописи представляет собой смесь из класса I и класса II коллагеназ с сбалансированное соотношение протеолитических деятельности. Кроме того решение пищеварение состоит из смеси коллагеназы, растворенных в той же базальной среде (IMDM) используется для подготовки C-MSC питательной среды, позволяя изолированных C-MSC адаптироваться к условиям будущего роста.

Кроме того хотя сортировка процедур может стандартизировать пакете ячейки, используя всего населения C-MSC, изолированные только через свойство пластиковых присоединения этих клеток, является упрощение не изменяя иммунофенотипических характеристики C-MSC. Состав ADIPO т., предложенные в этой рукописи способен привести к адипогенном дифференциации, избегая метаболических dysregulation, вызванных других компонентов, таких как инсулин.

Кроме того предлагаемый метод количественной оценки накопления липидов, который основывается на оценке интенсивности колориметрические Оро, предоставляет дополнительные сведения о количестве накопленных липиды, если по сравнению с методами, основанными только на процент клеток положительный пятнать Оро. Часто накопление липидов количественно путем извлечения Оро включены клетками с изопропанол и измерения его поглощения. Однако этот метод требует больше ходов и подвергается изменчивость из-за испарения изопропиловый спирт.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась министерством здравоохранения, Ricerca Corrente в Centro Cardiologico Monzino-IRCCS Италии.

Materials

IMDM Gibco by Life Technologies  12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
PENICILLIN STREPTOMYCIN Life Technologies Italia 15140122
Collagenase NB4 Serva 17454.02
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B
L-glutammine Sigma-Aldrich G7513
PBS Lonza 17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) Gibco 12563029
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Trypsin-EDTA solution  Sigma-Aldrich T6689
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS D.b.a. Italia S.r.l. sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855
Antibody CD14-FITC (MφP9) Becton Dickinson 345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) Becton Dickinson 561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11) R&D Systems FAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) Thermo Fisher Scientific  CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26) Becton Dickinson 561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) Thermo Fisher Scientific MHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) Becton Dickinson 561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) Becton Dickinson 562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizer Gima  35642
Bench centrifuge Sigma 3-16K Sigma Centrifuges 10330
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific  5100-0001
AxioVert 200M microscope  Zeiss B 40-080 e 03/01
FACS Gallios Beckman Coulter  773231AF
ImageJ (image processing program) NIH
Stericup filter units Merck S.P.A.  SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mL Eppendorf 30122178
Conical Tubes, 15 mL Eppendorf 30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430167
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430166
6 well TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Falcon 352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk Sigma-Aldrich BR719520
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
  2. Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
  3. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  4. Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, 36-51 (2017).
  5. Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
  6. Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
  7. Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
  8. Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
  9. Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
  10. Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
  11. Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
  12. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
  13. Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
  14. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  15. Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
  16. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).
  17. Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  18. Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
  19. Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
  20. Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
  21. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  22. Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  23. Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
  24. Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
  25. Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
  26. Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
  27. Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
  28. Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
  29. Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
  30. Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
  31. Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
  32. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
  33. From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 86 (11), 1095-1102 (2011).

Tags

Cardiac Mesenchymal Stromal CellsArrhythmogenic CardiomyopathyEndomyocardial BiopsyAdipogenic DifferentiationPhenotypingCell IsolationCell CultureCollagenase DigestionSurface Markers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pilato, C. A., Stadiotti, I., Maione, A. S., Saverio, V., Catto, V., Tundo, F., Dello Russo, A., Tondo, C., Pompilio, G., Casella, M., Sommariva, E. Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients. J. Vis. Exp. (132), e57263, doi:10.3791/57263 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image