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Developmental Biology

Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

Published: February 28, 2018
doi:
10.3791/57263
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1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health,Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

Summary

Neste artigo, é fornecido um método para isolar cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica bioptic amostras de pacientes de cardiomiopatia arrhythmogenic. Sua caracterização e o protocolo para impulsionar sua diferenciação de adipogenic são descritos.

Abstract

Um coração normal do adulto é composto de vários tipos de células diferentes, entre os quais células estromais mesenquimais cardíacas representam uma população abundante. O isolamento dessas células oferece a possibilidade de estudar o seu envolvimento em doenças cardíacas e, além disso, fornece um modelo útil de célula primária para investigar os mecanismos biológicos.

Aqui, o método para o isolamento de C-MSC bioptic amostras dos doentes de cardiomiopatia arrhythmogenic é descrito. A amostragem de biópsia endomiocárdica é guiada nas áreas adjacentes a cicatriz visualizada pelo mapeamento eletro-anatômicas ventrículo direito. A digestão das biópsias em seu revestimento em um prato de plástico em meio de cultura para permitir o crescimento de C-MSC e colagenase é descrita. As células isoladas podem ser expandidas em cultura para várias passagens. Para confirmar seu fenótipo mesenquimal, a descrição da caracterização imuno-fenotípica é fornecida. C-MSC são capazes de se diferenciar em vários tipos de células como os adipócitos, condrócitos e osteoblastos: no contexto da ACM, caracterizada por depósitos de adipócitos nos corações dos pacientes, os protocolos para a diferenciação de adipogenic de C-MSC e o caracterização de acúmulo de gotículas lipídicas são descritos.

Introduction

Células estromais mesenquimais (MSC) são células adultas com uma função de apoia importante em muitos tecidos1. Medula óssea representa a origem histórica do MSC, mas eles podem ser isolados de diferentes tecidos, incluindo a placenta, sangue do cordão umbilical, tecido adiposo, fígado e coração1,2.

Em 2006, a sociedade internacional para terapia celular (ISCT) especificado, pela primeira vez, os critérios mínimos para definir humano MSC3. Em particular, a MSC deve ter a capacidade de aderir ao plástico. Eles expressam antígenos de superfície específicos: a positividade para marcadores mesenquimais CD44, CD105, CD29 e CD90 e a negatividade para CD14, CD45, CD34, CD31 hematopoiéticas e endoteliais marcadores caracterizam MSC. Devido a expressão de falta de HLA-DR, MSC são incapazes de provocar alloreactivity. Além disso, eles são células com potencial para diferenciar-se em direção a adipogenic, condrócitos e osteoblastos linhagens1,3.

Com foco na composição celular cardíaca, células estromais mesenquimais cardíacas (C-MSC) são abundantes em um coração adulto normal4,5. Eles desempenham um papel crítico na função cardíaca normal e condições patológicas. Quando, fisiologicamente, C-MSC fornecem um microambiente que suporta a integridade estrutural e funcional do miocárdio, em doenças do coração, eles são ativados em resposta a lesão do coração participando de cicatrização de feridas e fibrótico remodelação6 ,7.

Recentemente, o envolvimento de C-MSC no arrhythmogenic substituição adiposa de cardiomiopatia (ACM) tem sido demonstrada8. Em particular, a ACM é uma desordem genética causada principalmente por mutações nos genes desmosomal que levam a substituição de fibro-gordos do miocárdio, principalmente no ventrículo direito9. Esta substituição, estendendo do epicárdio ao endocárdio, cria um substrato não-condutora que provoca progressiva insuficiência cardíaca e arritmias ventriculares, que podem levar, em casos graves, a morte súbita de piora. Sommariva et al demonstrada a origem mesenquimal de pre-adipócitos a presente nas seções de coração explantados dos pacientes ACM. Além disso, o C-MSC isoladas de biópsias endomiocárdica de genes de desmosomal expressa de corações ACM e, portanto, pode ser afetada por suas mutações. Em particular, sob condições de adipogenic, ACM C-MSC acumular lipídios mais do que aqueles de corações de controle. Esta evidência leva à conclusão de que C-MSC tanto ter um papel activo na patogênese da doença e representa um modelo de célula válida para estudar a ACM.

Para facilitar futuras pesquisas neste contexto ou em outras doenças de coração, para a qual é indicada uma biópsia cardíaca, um protocolo detalhado é apresentado para o isolamento de C-MSC de pequenos fragmentos de tecido endomiocárdica, sua expansão, sua imuno-fenotípica caracterização e diferenciação de adipogenic.

Protocol

Esta abordagem está em conformidade com a declaração de Helsínquia e a coleta de amostras de ventrículo direito foi aprovado (06/07/2012) pelo Comitê de ética do “Centro Cardiologico Monzino IRCCS”. 1. soluções Fazer média TMES para cultura C-MSC com modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM), suplementado com 20% soro Fetal bovino (FBS), 10 fator de crescimento fibroblástico básico ng/mL, 10.000 U/mL penicilina, 10.000 µ g/mL Estreptomicina e 0,02 M L-glutamina. O médio TMES usando uma unidade de filtro estéril de 0,22 µm de filtrar e armazenar a 4 ° C. Para preparar a solução de colagenase, resuspenda o mix de colagenase NB4 no meio de IMDM para obter uma solução final com uma concentração de 3 mg/mL. Vórtice suavemente para dissolver o pó e filtrar a solução de colagenase usando um filtro de seringa 0,2 µm. Volume de alíquota de 1 mL em tubos estéreis de 2ml e loja a-20 ° C até que seja necessário para o uso. Prepare o suporte de T. ADIPO, fazer adipogenic médio com médio IMDM suplementado com 10% FBS, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (previamente diluída em dimetilsulfóxido (DMSO) numa concentração de 0,5 M e mantido a-20 ° C até o uso), hidrocortisona 1 µM (pré-diluído em DMSO a 100 mM e mais diluído a 10 mM em estéril de água destilada e mantidos a-20 ° C até o uso) e 0,1 mM indometacina (previamente diluída em DMSO, numa concentração de 0,5 M e mantido a-20 ° C até o uso). O meio de T. ADIPO usando uma unidade de filtro estéril 0,22 µm de filtrar e armazenar a 4 ° C. Preparar o tampão de lavagem composta por tampão fosfato salino 0,0067 M PO4 (PBS), etilenodiamina tetra acético (EDTA) 5 mM e 5% de albumina de soro bovino e em 4 ° C. Prepare solução de trabalho óleo vermelho O (ORO) dissolução do pó ORO de 1% em 60% de isopropanol, misturando para 2 h, e filtragem usando uma unidade de filtro de 0,22 µm para remover precipitados. Armazene a solução à temperatura ambiente (RT). 2. isolamento de células estromais mesenquimais cardíacas Processamento e coleta de biópsia cardíacaNota: antes de começar, certifique-se de ter a solução de colagenase e meio de TMES pronto. Colocar a biópsia endomiocárdica ACM (geralmente cerca de 5 mg de tecido) em um tubo estéril cheia de TMES e transportá-lo para o laboratório.Nota: Biópsias ACM são coletadas na sala de operação de eletrofisiologia, de acordo com o de relatórios anteriores10. Brevemente, a integração de mapeamento eletro-anatômicas e ecocardiografia intracardíaca no ventrículo direito (ver vídeo 1) é usada para guiar a biópsia endomiocárdica (ver vídeo 2, fluoroscopia) em correspondência com a zona de fronteira do miocárdio doente. Amostras de controle (HC) saudável são fornecidas por um bio-banco de tecidos, obtido a partir da parede livre ventricular direita de doadores cadavéricos dentro de 24 horas da morte (morte acidental, indivíduos saudáveis). Durante o transporte e antes da dissecação, armazenar a biópsia no TMES no 4 ° C. Limite o tempo entre a coleta de biópsia e processamento de tecido (máx. 24 h). Configure a segurança biológica do armário com as soluções necessárias para realizar o procedimento até a digestão enzimática. Colocar o esterilizador sob o capô e ligue o instrumento 15 min antes de usar, até que a temperatura se eleva a 200-250 ° C. Esterilize a tesoura e pinça para fazer s. 10 os instrumentos esterilizados com certeza frios antes do uso. Prepare os bisturis estéril descartáveis. Coloque os tubos com a biópsia do capuz estéril. Abra o tubo e transferir a biópsia em uma placa estéril. Lave a biópsia de ventrículo direito duas vezes com 3 mL de PBS estéril. Se você quer tire uma foto da biópsia no microscópio. Transferi a biópsia do ventrículo direito, usando uma pinça estéril, em um tubo estéril de 2 mL contendo 1 mL da solução de colagenase. Corte a amostra em 0,5 – 1 mm3 peças com tesoura esterilizada. Incube durante 1,5 h a 37 ° C, sob agitação contínua rotativa. Centrifugue a solução digerida a 400 x g durante 10 minutos a RT Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de PBS estéril para lavar o sedimento. Centrifugar a 400 x g por 10 min a RT. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de meio TMES. A suspensão obtida na placa de cultura de tecidos estéreis-60mm tratada da placa e adicione meio TMES até o volume final de 3 mL. Incube a placa em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C com 5% de CO2.Nota: Um maior volume de meio pode impedir a correta adesão dos fragmentos biópsia digerido. Após 24h, descarte o meio para remover detritos e células não-aderentes.Nota: Células mesenquimais dissociadas única podem anexar à superfície plástica e dão origem a clones; também, fragmentos de biópsia pequena não digerida podem anexar para o prato de plástico e permitir que celulares brotando. Lavar a placa duas vezes com 5 mL de PBS estéril e adicionar 3 mL de meio fresco TMES. Substitua o médio TMES três vezes por semana até que as células são 80% de Confluencia.Nota: O número de células anexados depende a qualidade, a quantidade de tecido e a eficiência da digestão. 3. célula expansão Nota: Antes de começar, certifique-se de ter médio TMES pronto. Quando as células são confluentes, transferência de 80% as digerido pequenas amostras bioptic em uma nova cultura de tecido estéril-60mm trataram placa e adicionam 3 mL de meio fresco TMES.Nota: As amostras de bioptic podem ser re-utilizadas para isolamento de C-MSC ainda mais. É possível repetir este procedimento até que haja um número significativo de células isoladas. Lave as células anexadas duas vezes com 3 mL de PBS estéril. Adicionar a solução do trypsin-EDTA (0,5 mL para um prato de 60-mm) e incubar a 37 ° C, durante 3-5 min permitir o desprendimento de células. Quando as células são desanexadas da superfície da placa, adicione 0,5 mL de FBS estéril para inactivar a tripsina e coletar as células em um novo tubo estéril de 50 mL. Lave a placa duas vezes com 5 mL de PBS estéril para adicionar as células restantes para o mesmo tubo. Centrifugar as células a 400 x g durante 10 minutos a RT Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de meio TMES. Carrega 10 µ l de suspensão de célula na célula contando a câmara.Nota: Se as células são muito concentradas, diluir a suspensão inicial 01:10 em PBS e 10 µ l de células diluídas na célula contagem câmara de carga. Sob o microscópio, contar as células em 3 grandes praças e nas linhas de dois dos seus lados e calcular o número médio de células.Nota: Para obter o número de células/mL, a média de células contadas é multiplicada por 104, o fator de diluição da célula contando a câmara. Se as células têm sido ainda mais diluídas, multiplica-se para o factor de diluição. A relação entre o número de células a semente e a concentração de células (número de células/mL) corresponde ao volume (em mL) da suspensão inicial a ser chapeado para a próxima etapa (ponto 3.9). Placa a ressuspensão em placas de cultura de tecidos estéreis 100mm tratada em uma concentração final de 5.000-10.000 células/cm2 e adicionar médio TMES até o volume final de 8 mL. Incube a placa em uma incubadora de cultura de células.Nota: Repita o procedimento de expansão de célula quando as células são confluente de 70-80%. Em cada passagem (P), é recomendado para cryopreserve parte das pilhas e do prato, a quantidade restante. Expandir as células até P3 ou P4 e usar para análise de classificador (FACS) fluorescente-ativado da pilha (seção 4) e a diferenciação de adipogenic (secção 5). Para a criopreservação após descolamento, Centrifugar as células a 400 x g durante 10 minutos a RT Contagem de células como descrito (etapas 3.7-3,8) e ressuspender 1 x 106 células em 900 µ l de FBS estéril. Transferir para um crio-frasco estéril e adicionar 100 µ l de estéril DMSO e misture. Rapidamente, conservar os frascos de cryo-em um recipiente de congelamento a-80 ° C durante pelo menos 2 dias e depois transferir os frascos em nitrogênio líquido. 4. caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais por citometria de fluxo Nota: Antes de começar, certifique-se de ter o eritrócito de dissociação, buffer e os anticorpos específicos preparados de lavagem. Quando o número de células atinge pelo menos 3 x 106 (contagem das células como descritas em 3,7-3,8), lavar a placa de 100mm duas vezes com 10 mL de PBS estéril. Adicionar 5 mL de um eritrócito de dissociação e esperar 7 a 10 min a RT para permitir o desprendimento de células. Quando as células são desanexadas da superfície da placa, adicionar 15 mL de tampão de lavagem estéril e coletar a suspensão em um novo tubo estéril de 50 mL. Lavar a placa duas vezes com 10 mL de tampão de lavagem e adicionar as células restantes para o mesmo tubo. Centrifugar as células a 400 x g durante 10 minutos a RT e resuspenda o pellet em 1 mL de tampão de lavagem. Contar as células como descritas (etapas 3.7-3,8) e transferir 3 x 106 células para um tubo estéril de novo e adicionar o tampão de lavagem para o volume final de 1,5 mL.Nota: O número total de células e o volume total de tampão de lavagem depende do número de marcadores selecionados utilizados para a análise (3 x 105 células em 100 µ l de cada tubo de poliestireno FACS). Distribuir 100 µ l de suspensão celular em 12 diferentes tubos de poliestireno de FACS e adicione o anticorpo específico na concentração indicada na ficha técnica do produto.Nota: Os anticorpos utilizados para caracterização de C-MSC são CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 e HLA-DR (tabela 1). É importante preparar uma amostra de controle composta de 100 µ l de ressuspensa células manchadas com o isotipo controle para verificar a especificidade do sinal. Incube as amostras por 15 min no escuro. Adicione 1 mL de tampão de lavagem estéril para cada tubo para parar a reação. Centrifugar as células a 400 x g durante 10 minutos a RT Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 250 µ l de tampão de lavagem. Proceda à caracterização de C-MSC com citometria de fluxo. 5. Adipogenic diferenciação de células estromais mesenquimais cardíacas Nota: Antes de começar, certifique-se de ter preparado médio T. ADIPO e solução de trabalho de ORO. Cultura em meio de ADIPO T. Separar e contar as células conforme descrito na seção 3. Células de5 placa de 3 x 10 para cada poço de cultura de tecido estéril 6-bem trataram placa de 2 mL do meio de ADIPO T.. Deixe C-MSC diferenciar no meio de T. ADIPO para 72 h ou 1 semana, alterando o meio de cada 2-3 dias. Manchando de vermelho O óleoNota: uso óleo vermelho O (ORO) coloração para testar o acúmulo de lipídios no C-MSC. Coloque o plateunder de cultura de tecidos de 6-poços a coifa. Retire o meio de adipogenic e lave as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicionar o volume suficiente de paraformaldeído 4% (PFA) para cobrir cada um bem. Consertar as células durante 5 min à RT Descartar o PFA e lavar as células duas vezes com 2 mL de PBS. Incube as celulas fixas com solução de trabalho de ORO por 1h no RT, com volume suficiente para cobrir cada um bem.Nota: Não manter a placa de cultura de tecidos de 6-poços sob a coifa durante incubação ORO para evitar a evaporação da solução de trabalho de ORO. Remova toda solução de trabalho de ORO e lave com 2 mL de PBS 3 – 5 vezes até que a placa está completamente limpo; Descarte de lavagens. Pare as lavagens quando usado o PBS é clara, e quando você não vê, sob o microscópio, inespecíficos coloração fora das células. Captura de 20 imagens na ampliação de 20 X para cada poço usando o microscópio de contraste de fase invertida de cultura de tecidos. Abra as fotos com o programa de processamento de imagem para quantificar a célula acumulação de ORO. Separe os canais de cor diferente através da função “dividir canais” a fim de quantificar apenas a luminância no canal vermelho-255. Conte o número de células para cada foto contando os núcleos. Normalize a intensidade do sinal ORO sobre o número de células. Calcule a média dos resultados obtidos para cada foto da mesma amostra.

Representative Results

Cardíaco stromal células isolamento: O isolamento de C-MSC do procedimento de biópsia endomiocárdica está resumido na Figura 1. Cardíaco stromal células mesenquimal caracterização: Conforme estabelecido pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT), os critérios mínimos para a definição de células estromais mesenquimais multipotentes inclui sua caracterização fenotípica imuno3. Em particular, para confirmar sua linhagem mesenquimal, células são incubadas com anticorpos FITC/PE/APC-conjugados apropriados e analisadas por citometria de fluxo. Todos os anticorpos utilizados na caracterização C-MSC são listados na Tabela de materiais. Conforme ilustrado na Figura 2, C-MSC obtida biópsias são positivos para os específicos mesenquimais antígenos de superfície CD29, CD44 e CD105. A porcentagem de células positivas CD90 é variável, conforme relatado anteriormente,11. O endotelial (CD31, CD34), monócitos/macrófagos (CD14), hematopoiéticas (CD45) marcadores e complexo de histocompatibilidade (HLA-DR) não são expressos (Figura 2). Diferenciação de adipogenic células estromais mesenquimais cardíaco: Para solicitar sua diferenciação de adipogenic, C-MSC obtido de pacientes afetados por ACM e HC tem que ser cultivadas em meio de T. ADIPO (consulte a seção de soluções). As células são mantidas em cultura por 72 h ou 1 semana, substituindo a média duas vezes por semana. O acúmulo de gotículas lipídicas intracelulares é evidenciado pelo ORO coloração (Figura 3). Diferenças na capacidade, bem como no grau de diferenciação, podem ser observadas entre as células obtidas de ACM e HC. Como mostrado nas imagens representativas, ACM C-MSC acumula gotículas lipídicas mais do que HC C-MSC após 72 h de cultura em meio de adipogenic (Figura 3). Estas diferenças são mantidas também quando as células são expostas a condições de diferenciação de adipogenic por um longo período (1 semana) (Figura 3). Vídeo 1: Integração do mapa de electroanatomical e ecocardiografia intracardíaca. Endocárdico unipolar electroanatomical mapas do ventrículo direito (esquerdo anterior oblíqua e anterior direita oblíqua) em um paciente que sofre de biópsia endomiocárdica (painéis inferiores). Áreas limitadas de baixa tensão (vermelho/verde) são visíveis no ápice. Amostras de bioptic endomiocárdica (marcadas como círculo) são coletadas em correspondência para o miocárdio doente e o septo interventricular. Ecocardiografia intracardíaca em tempo real permite verificar a posição correcta do bioptome na área de alvo (painel superior). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.) Vídeo 2: vídeo de fluoroscopia em vista oblíqua anterior direita. O bioptome é inserido através de uma bainha longa-deflector e avançado para o ventrículo. Após uma cuidadosa verificação do bioptome contato com o miocárdio, as mandíbulas são abertas e então firmemente fechadas para coletar a amostra. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.) Figura 1: projecto procedimento. A amostra bioptic endomiocárdica é coletada utilizando um cateter de bioptome, um instrumento de corte pequeno em forma de pinça. O peso da biópsia obtida é aproximadamente de 5 mg (A). A amostra bioptic endomiocárdica é picada em 0.5 – fragmentos de3 de 1 mm, com uma tesoura esterilizada (B), e a solução de colagenase é adicionada. A amostra é colocada em uma incubadora de 37 ° C em um misturador plataforma rotativa para 1,5 h de digestão (C). A solução digerida é centrifugada e banhada em TMES em um prato de plástico (D). C-MSC são obtidos graças a suas propriedades de aderência de plástico nas células únicas ou clones ou brotando de pequenos fragmentos bioptic não digeridos (E). Em seguida, C-MSC caracterizam-se por citometria de fluxo (F). C-MSC são banhados em adipogenic médio e acúmulo de gotículas lipídicas é testado pelo óleo vermelho O mancha (G). Escala barras indicam 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: perfil representativo cyto-fluorimétrica de C-MSC. Cada histograma mostra a contagem de células versus a intensidade de fluorescência no canal indicado (PE: ficoeritrina; APC: allophycocyanin; FITC: fluoresceína-isothyocyanate). Em cada gráfico de controle isotype (branco) e uma amostra conjugados com a célula específica anticorpo marcador de superfície (vermelho) são mostrados. C-MSC são positivos para os mesenquimais antígenos de superfície CD29, CD44, CD105 e, parcialmente, para CD90, Considerando que eles não expressam CD31, CD34, CD14, CD45 e HLA-Dr. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Adipogenic diferenciação de C-MSC. Imagens representativas de ACM e HC C-MSC, cultivadas em meio de adipogenic para 72 h e 1 semana, manchada de ORO (fotos à esquerda; n = 3). Nos gráficos a razão, quantificação de luminância de manchar o canal vermelho-255 é relatada: intensidade é expressa em unidades arbitrárias (U.A.). C de ACM-MSC acumular mais gotículas lipídicas do que os controles. Foi utilizado o teste T de Student, *: p < 0,05. Escala barras indicam 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

MSC e C-MSC: MSC são células residentes na fração do estroma dos diferentes tecidos adultos, tais como a medula óssea, tecido adiposo, cartilagem, cérebro, pele, anexos fetais e coração12. Diversos estudos têm sido realizados para isolar e caracterizá-las para potenciais aplicações na pesquisa básica e translacional12,13.

Em condições saudáveis, MSC são quiescentes, auto renovadora às baixas taxas de14. Uma vez que eles estão expostos a mudanças patológicas ambientais, reagem fomentar remodela o tecido através de transdiferenciação celular direto, deposição de matriz ou o efeito de parácrina14.

O MSC cardíaca (C-MSC) representam uma população de células grandes não-miócito do coração4. Eles se originam o epicárdio e migram para o miocárdio, o processo de transição epitelial-para-mesenquimais15. Eles contribuem para a integridade mecânica e elétrica da estrutura cardíaca, tanto no fisiológico, como em estados patológicos, por meio de interações com cardiomyocytes e matriz extracelular homeostase7,16. No entanto, as funções de ampla gama de C-MSC é ainda não completamente entendido. Um conhecimento mais profundo de seu papel que tanto em condições fisiológicas e patológicas podem ser facilitados em vitro estudos realizados após seu isolamento.

C-MSC foram obtidos de diferentes distritos do coração humano, como o apêndice atrial2,17 e o ventrículo direito18.

Recentemente, C-MSC de amostras bioptic endomiocárdica ventrículo direito humano foram obtidos8, demonstrando que o tecido de origem poderia ser tão pouco como 3-5 mg.

Aplicações possíveis: O método descrito neste manuscrito permite a obtenção de células com poucas passagens simples, tais como digestão e seleção para aderência de plástico, de espécimes muito pequenos de coração.

C-MSC pode ser considerado um modelo de célula, uma vez que são fáceis de ampliar e manter em vitroe são capazes de se diferenciar em células de linhagem mesenquimal (endotélio, osteócitos e adipócitos). Além disso, a possibilidade de obter células diretamente de pacientes constitui uma ferramenta de grande em vitro para estudos mecanicistas no contexto da medicina personalizada/precisão. Com efeito, estas células carregam o fundo genético e mutações eventualmente específicas dos doadores e são influenciadas pelas características específicas dos pacientes, tais como condições clínicas, idade, sexo, estilo de vida e medicamentos. Além disso, a possibilidade de classificando-os por diferentes marcadores pode permitir o estudo das específicas de subconjuntos de C-MSC19.

C-MSC são conhecidos por serem jogadores ativos em diferentes doenças cardiovasculares, principalmente caracterizadas pela remodelação adversos do coração. Portanto, eles representam metas de candidatos para novas estratégias terapêuticas combater doenças cardíacas8,20.

C-MSC haste-como propriedades e sua falta de imunogenicidade significativa sugere sua potencial aplicação em terapia celular para cardíaca medicina regenerativa. Com efeito, como MSC da medula óssea ou de outras fontes, C-MSC poderia ser potencialmente usada autólogo e alogênico configurações, sem a necessidade de correspondência entre o dador e o receptor21.

Além disso, o C-MSC, sendo isolado diretamente do tecido cardíaco, têm a vantagem de ser pré-condicionado pela microambiente cardíaco e perfil epigenético. No contexto da medicina regenerativa cardíaca, isto pode ser particularmente importante para obter resultados de sucesso.

Até à data, estudos pré-clínicos de medicina regenerativa identificaram potencial terapêutico útil em C-MSC e seus parácrina atividade18,22,23. Importante, os ensaios clínicos em que a fonte da célula é o coração estão em andamento com cardiosfere-derivado de células ou com subpopulações de C-MSC13,24,25. No entanto, quanto ao osso-medula-derivado MSC, protocolos diferentes podem ser necessários para obter o grau clínico C-MSC26.

C-MSC em ACM: O protocolo apresentado é principalmente apropriado para o estudo das patologias para as quais é indicada uma biópsia endocárdico. ACM de pacientes submetidos a procedimentos bioptic para fins de diagnóstico,27. O miocárdio é gradualmente substituído por tecido da cicatriz, um tecido inerte eletricamente composto de adipócitos e fibrose. Para orientar a bioptic amostragem para a área de cicatriz, onde o rendimento diagnóstico é máximo, endomiocárdica mapeamento é usado10,28,29. As amostras utilizadas neste protocolo são tomadas na zona de fronteira do miocárdio doente.

Et al . Sommariva definiu recentemente um papel fulcral de C-MSC na patogênese da ACM8, demonstrando que o C-MSC são jogadores ativos no ACM coração adipogenesis, desde preadipocytes nesses corações são de origem mesenquimal. Além disso, o C-MSC isolado com o presente protocolo de biópsias dos pacientes ACM mostrou mais propensão ao acúmulo de lipídios e adipogenesis que controles. Por esta razão, estas células podem ser usadas para confirmar alguns dos mecanismos moleculares de ACM, provando sua adequação como um modelo de célula para estudos mecanicistas9.

Passos críticos e limitações: Apesar das vantagens da obtenção de C-MSC diretamente de pacientes (ver o parágrafo “Possíveis aplicações”), este protocolo é submetido a diferentes limitações.

Em primeiro lugar, o procedimento de bioptic cardíaco é invasivo e muitas vezes evitada se não é estritamente necessário. Na verdade, tecido cardíaco de amostragem é tanto eticamente e tecnicamente problemático. Razões para a realização de uma biópsia cardíaca pode ser a realização de um diagnóstico definitivo no contexto de cardiomiopatias no diagnóstico diferencial, monitoração do status de transplantes cardíacos, ou verificar a presença de um tumor de coração30. Portanto, apenas os pacientes para os quais uma biópsia endomiocárdica é indicada pela declaração de consenso31 podem ser inscrito para pesquisa no C-MSC. Além disso, o procedimento de bioptic cardíaco pode ter complicações clínicas, sobretudo em corações cardiomyopathic. Portanto, amostragens do eletrofisiologista sempre são prudentes e bioptic amostras podem ser muito pequenas, comprometer o isolamento de células. Experiências futuras poderiam superar esta questão por ajuste concentração de colagenase ou tempo de digestão.

C-MSC, como todas as células humanas primárias, mostram uma grande variabilidade entre diferentes disciplinas em todos os fenótipos. Com efeito, células de indivíduos diferentes não são apenas geneticamente diferentes, mas também submetido ao condicionamento ambiental variável. Especificamente, dentro desta experiência, é observada uma alta variabilidade na diferenciação celular de isolamento, crescimento e adipogenic.

Passos críticos do presente protocolo tem que ser reconhecido. Se a amostra bioptic inclui capilares, eles devem ser removidos para evitar o isolamento paralelo das células endoteliais, que possam contaminar a cultura C-MSC e pode ser evidenciado pela análise de FACS (positividade para CD31). Para obter uma diferenciação de adipogenic eficiente, as células devem ser em uma fase de crescimento ativo. O grau de confluência também pode influenciar o acúmulo de lipídios.

Importância do método: No que diz respeito a métodos anteriores de isolamento das células estromais mesenquimais, esta é a primeira vez onde a descrição de obtenção de C-MSC diretamente de amostras de bioptic ventriculares humanas é proposta em detalhe. Embora este método é sugerido para o processamento de amostras de pacientes de ACM, é potencialmente aplicável a todos os pacientes para os quais é indicada uma biópsia cardíaca.

Este protocolo representa uma implementação útil anteriores métodos para a obtenção de células que exigia maiores amostras cardíacas32, que muitas vezes são difíceis de coletar.

Além disso, a fonte da amostra constitui uma inovação interessante. Enquanto a biópsia ventricular é geralmente realizada sobre o septo33, este protocolo leva em conta as amostras obtidas da parede livre do ventrículo direito. Células derivadas de doente distrito de ventrículo direito podem ser mais representativo do estado patológico das doenças envolvendo RV

Além disso, alguns dos reagentes usados no presente protocolo são diferentes em relação a outros C-MSC isolamento e diferenciação métodos32. Por exemplo, o tipo de colagenase proposto neste manuscrito é uma mistura de classe I e classe colagenases II com uma relação equilibrada de atividades proteolíticas. Além disso, a solução de digestão é composta da colagenase mistura dissolvida no mesmo meio basal (IMDM) usado para a preparação do meio de cultura C-MSC, permitindo C-MSC isolado para se adaptar às condições de crescimento futuro.

Além disso, embora os procedimentos de classificação poderia padronizar o lote de célula, usando toda a população C-MSC, isolado apenas através da propriedade de plástico aderência destas células, constitui uma simplificação sem alterar a imunofenotípica características do C-MSC. A composição do T. ADIPO proposto neste manuscrito é capaz de levar a diferenciação de adipogenic, evitando a desregulação metabólica induzida por outros componentes, como a insulina.

Além disso, o método proposto de quantificação de acumulação de lipídios, que se baseia a avaliação da intensidade colorimétrica ORO, fornece mais informações sobre a quantidade de lipídeos acumulados, se comparada com métodos baseados apenas na porcentagem de células positivas para a coloração de ORO. Muitas vezes o acúmulo de lipídios é quantificado pela extração do ORO incorporados pelas células com isopropanol e medir sua absorbância. No entanto, este método requer mais passagens e está sujeita à variabilidade devido à evaporação de isopropanol.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Ministério italiano da saúde, Ricerca Corrente para Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materials

IMDM Gibco by Life Technologies  12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
PENICILLIN STREPTOMYCIN Life Technologies Italia 15140122
Collagenase NB4 Serva 17454.02
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B
L-glutammine Sigma-Aldrich G7513
PBS Lonza 17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) Gibco 12563029
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Trypsin-EDTA solution  Sigma-Aldrich T6689
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS D.b.a. Italia S.r.l. sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855
Antibody CD14-FITC (MφP9) Becton Dickinson 345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) Becton Dickinson 561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11) R&D Systems FAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) Thermo Fisher Scientific  CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26) Becton Dickinson 561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) Thermo Fisher Scientific MHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) Becton Dickinson 561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) Becton Dickinson 562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizer Gima  35642
Bench centrifuge Sigma 3-16K Sigma Centrifuges 10330
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific  5100-0001
AxioVert 200M microscope  Zeiss B 40-080 e 03/01
FACS Gallios Beckman Coulter  773231AF
ImageJ (image processing program) NIH
Stericup filter units Merck S.P.A.  SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mL Eppendorf 30122178
Conical Tubes, 15 mL Eppendorf 30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430167
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430166
6 well TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Falcon 352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk Sigma-Aldrich BR719520
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Pilato, C. A., Stadiotti, I., Maione, A. S., Saverio, V., Catto, V., Tundo, F., Dello Russo, A., Tondo, C., Pompilio, G., Casella, M., Sommariva, E. Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients. J. Vis. Exp. (132), e57263, doi:10.3791/57263 (2018).
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