催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

このアプローチは、ヘルシンキ宣言に準拠しているし、右室サンプルのコレクションだった「セントロ Cardiologico Monzino IRCCS」倫理委員会承認 (2012/07/06). 1. ソリューション C MSC 文化の媒体と Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM)、20% を添加した胎仔ウシ血清 (FBS)、10 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子、10,000 U/mL ペニシリン、10,000 μ g/mL ストレプトマイシン、0.02 M L-グルタミン。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用してこのメディアをフィルター処理し、4 ° C で保存 コラゲナーゼの解決を準備するには、3 mg/mL の濃度で最終的な解を得るための IMDM 媒質中のコラゲナーゼ NB4 ミックスを再懸濁します。優しく、粉溶解して 0.2 μ m のシリンジ フィルターを用いたコラゲナーゼの解決をフィルターする渦。分注 1 mL 量 2 mL 滅菌チューブに-20 ° c まで使用するために必要なストア。 10 s、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (事前 0.5 M の濃度でジメチルスルホキシド (DMSO) で希釈し、使用するまで-20 ° C で保管)、1 μ M ヒドロコルチゾン (前希釈で補われる t. 裏打ちメディアの準備、IMDM 中脂肪分化培地を作る100 mM とさらに 10 mm の滅菌希釈で DMSO で蒸留水し、使用するまで-20 ° C で保管) と 0.1 mM インドメタシン (済み DMSO 0.5 M の濃度で希釈品し、使用するまで-20 ° C で保存)。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用して t. 裏打ち媒体をフィルター処理し、4 ° C で保存 リン酸緩衝生理食塩水 0.0067 M PO4 (PBS)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) から成る洗浄バッファーを準備 5 mM と 5% ウシ血清アルブミンおよび 4 ° C でのストア 60% イソプロパノールで 1% のオロの粉末を溶解、2 h の混合、0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して沈殿物を削除するフィルタ リング オイル赤い O (オロ) 実用的なソリューションを準備します。保管常温 (RT) 作業ソリューションです。 2. 間葉系間質細胞の分離 心筋生検の収集と処理注:前に、コラゲナーゼの解決と準備ができてこの媒体を持っているを確認します。 ACM 心内膜心筋生検を置く (通常約 5 mg の組織) 生殖不能の管に手ごろでいっぱいし、研究室にそれを輸送。注:ACM の生検は、以前のレポート10によると電気生理学手術室で収集されます。簡単に言えば、電気解剖学的マッピングと右心室の心腔内エコーの統合を使用して心内膜心筋生検 (ビデオ 1参照) (ビデオ 2、参照透視) の国境地帯への対応で、病的心筋。健康な制御 (HC) サンプルは、死体ドナー死亡 (事故死、健常者) の 24 時間以内の右室自由壁から得られる組織バイオ-銀行、によって提供されます。輸送中および郭清の前に、4 ° C で手ごろで生検を格納します。生検コレクションとティッシュの処理 (最大 24 時間) の間の時間を制限します。 酵素消化までの手順を実行する必要なソリューションとキャビネット生物学的安全性を設定します。 フードの下で殺菌剤を入れて、楽器使用前に 15 分に回して温度上昇 200-250 ° c. 消毒はさみとピンセット 10 s. 作る確か滅菌器具は使用前に冷たい。使い捨て滅菌メスを準備します。 無菌フードに生検でチューブを配置します。管を開き、滅菌プレートに生検を転送します。 3 mL の滅菌 PBS で 2 回右心室生検を洗います。顕微鏡で生検の写真を撮る場合。 生検の結果, 右心室のコラゲナーゼ溶液 1 mL を含む滅菌 2 mL チューブに滅菌ピンセットを使用して転送します。 滅菌ハサミで 0.5 – 1 mm の3個セットにサンプルをカットします。 連続回転攪拌下の 37 ° C で 1.5 時間孵化させなさい。 消化液室温 10 分 400 × g で遠心分離します。 上澄みを除去し、ペレットを洗浄する滅菌 PBS の 1 mL を追加します。 室温 10 分 400 × g で遠心します。 上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。 処理滅菌 60 mm 組織培養プレート上に得られた懸濁液をプレート、この媒体を 3 mL の最終的なボリュームに追加します。プレート 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。注:媒体の高いボリュームは、生検消化断片の正しい接着を防ぐことができます。 24 h 後非付着性のセルおよび残骸を削除する媒体を破棄します。注:単一の解離の間葉系細胞ことができるプラスチック面にアタッチしてクローン; を生じまた、未消化の小さな生検フラグメントは、プラスチックの皿にアタッチし、セル萌芽を許可できます。 滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄して新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。 セルが 80% 合流まで週に何回この中 3 つを交換してください。注:接続されているセルの数は品質、組織の量と消化の効率に依存します。 3. 細胞伸長 注:開始する前に、この媒体の準備を持っていることを確認します。 セルが 80% 合流、転送新しい滅菌 60 mm 組織培養に消化された小さな生検サンプル プレートを扱われ、新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。注:生検サンプルはさらに C MSC 分離再利用することができます。単離細胞のかなりの数になるまでこの手順を繰り返すことが可能です。 3 mL の滅菌 PBS で 2 回添付セルを洗浄してください。トリプシン EDTA 溶液 (60 mm ディッシュ用 0.5 mL) を加え、細胞の剥離を許可する 3-5 分の 37 ° C で孵化させなさい。 プレートの表面から細胞を取り外したら、トリプシンを不活化し、新しい 50 mL 滅菌チューブに細胞を収集する滅菌 FBS の 0.5 mL を追加します。 同じチューブに残りのセルを追加する滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄します。 室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。 上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。 商工会議所を数えるセルの細胞懸濁液の 10 μ L をロードします。注:セルは、あまりにも集中している場合、初期懸濁液 1:10 PBS で希釈し、カウント部屋のセルに希薄化後の細胞の 10 μ L を読み込みます。 顕微鏡で 3 大きな正方形とその両側の 2 つの行のセルをカウントし、平均細胞数を計算します。注:セル/mL の数を得るためには、カウントが設定されたセルの平均値に 10 を掛ける4、カウント部屋セルの希釈係数。セルがさらに希釈されている場合は、希釈倍率の乗算します。シードする細胞数と細胞濃度 (セル/mL の数) 間の比率は、次のステップ (3.9 ポイント) にメッキする初期懸濁液量 (mL) でに対応します。 5,000-10,000 のセル/cm2の最終的な集中で扱われる滅菌 100 mm 組織培養プレートに巻き上がりをプレート、この媒体を 8 mL の最終巻に追加します。細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。注:セルが 70-80% の合流は、セル拡張手順を繰り返します。すべての通路 (P) では、セルとプレート残りの金額の一部を凍結保存することをお勧めします。P3 や P4 までセルを展開し、蛍光活性化細胞選別機 (FACS) 解析 (セクション 4)、脂肪細胞分化 (セクション 5) を使用します。 剥離後凍結、室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。 としてセルを数える (ステップ 3.7 3.8) と 900 μ L 滅菌 FBS の 1 x 106細胞を再懸濁します。無菌低温バイアルに転送し、100 μ L の滅菌の DMSO とミックスを追加します。 すぐに、少なくとも 2 日間-80 ° c の凍結容器にクライオ バイアルを格納し、液体窒素にバイアルを転送します。 4. フローサイトメトリーを用いた間葉系間質細胞のキャラクタリゼーション 注:始める前に、細胞解離試薬、洗浄バッファー、および準備特定の抗体を持っていることを確認します。 細胞の数に達すると、少なくとも 3 x 106 (3.7 3.8 で説明したセルとしてカウント) は 10 mL の滅菌 PBS で 2 回 100 mm プレートを洗います。 細胞解離試薬の 5 mL を追加し、細胞の剥離を許可する RT で 7 ~ 10 分を待ちます。 プレートの表面から細胞を取り外したら、15 mL の滅菌洗浄バッファーを追加し、新しい 50 mL 滅菌チューブに懸濁液を収集します。 洗浄液 10 mL で 2 回洗浄し、残りのセルを同じ管に追加します。 RT で 10 分の 400 x g で細胞を遠心し、洗浄液の 1 mL にペレットを再懸濁します。 説明されている (手順 3.7 3.8)、としてセルをカウントし、新しい生殖不能の管に 3 x 10 の6セルを転送 1.5 mL の最終巻に洗浄バッファーを追加します。注:総細胞数と洗浄バッファーの容量解析 (3 x 105セル各 FACS ポリスチレン管用 100 μ L) に使用される選択したマーカーの数に依存します。 配布 12 異なる FACS ポリスチレン管、細胞懸濁液を 100 μ l 添加し製品データシートに示された濃度で特定の抗体を追加します。注:C MSC 特性評価用抗体、CD34、CD105、CD45、(cd29)、CD90、CD44、CD31、CD14、および HLA-DR (表 1)。再懸濁細胞シグナルの特異性をチェックするアイソタイプ コントロールで染色の 100 μ L から成るコントロールのサンプルを準備することが重要です。 暗闇の中で 15 分間サンプルをインキュベートします。 反応を停止する各管に 1 mL の滅菌洗浄バッファーを追加します。 室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。 上澄みを除去し、洗浄バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。 フローサイトメトリーによる C MSC 特性に進みます。 5. 心臓間葉系間質細胞が分化 注:始める前に、t. 裏打ち媒体とオロ実用的なソリューションを用意してください。 T. 同定培地で培養 デタッチし、セクション 3 で説明したセルをカウントします。 プレート 3 × 105セル 6 ウェル組織培養の各ウェルには、T. 裏打ち培地 2 mL にプレートを扱われます。 C MSC t. 裏打ち中 72 時間または 1 週間変更中 2 〜 3 日ごとに区別ができます。 オイル赤 O 染色注:使用オイル赤い O (オロ) C MSC の脂質蓄積をテストする染色します。 6 ウェル培養 plateunder ヒューム フードを配置します。 脂肪細胞の培地を取り除き、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。 4% のパラホルムアルデヒド (PFA) それぞれをカバーするための十分なボリュームを追加も。室温 5 分のセルを修復します。 PFA を破棄し、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。 RT、それぞれをカバーする十分なボリュームを使用して、1 時間オロ実用的なソリューションと固定セルを孵化も。注:オロ オロ作業溶液の蒸発を避けるために潜伏中にヒューム フードの下で 6 も組織培養プレートを保持しません。 すべてオロ実用的なソリューションを取除き、洗浄 2 ml の PBS 3 – 5 回までプレートが完全にクリーンアップ。洗浄を破棄します。使用される PBS が明らかなときと非特異的細胞から染色顕微鏡の下で、表示されない場合は、洗浄を停止します。 培養倒立位相差顕微鏡を使用して各ウェルの 20 倍の倍率で 20 枚の画像をキャプチャします。 セル オロ蓄積を定量化するための画像処理プログラムで写真を開きます。 255 赤チャネルの輝度のみを定量化するために「チャンネルを分割」機能で別の色チャンネルを分離します。 核を数えることによって各画像のセルの数をカウントします。セル数にオロ信号強度を標準化します。 同じサンプルの各画像の結果の平均を計算します。