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Developmental Biology

Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

Published: February 28, 2018
doi:
10.3791/57263
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1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health,Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

Summary

In questo articolo viene fornito un metodo per isolare cellule stromale mesenchymal cardiache da endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena. Loro caratterizzazione e il protocollo per aumentare la loro differenziazione adipogenico sono descritti.

Abstract

Un cuore adulto normale è composto da diversi tipi di cellule diverse, tra cui le cellule stromale mesenchymal cardiache rappresentano una popolazione abbondante. L’isolamento di queste cellule offre la possibilità di studiare il loro coinvolgimento nelle malattie cardiache e, inoltre, fornisce un modello di cellula primaria utile per studiare i meccanismi biologici.

Qui, è descritto il metodo per l’isolamento del C-MSC da campioni bioptici dei pazienti cardiomiopatia aritmogena. Il campionamento di biopsia endomiocardica è guidato in ventricolare destro aree adiacenti alla cicatrice visualizzata tramite mappatura electro-anatomico. La digestione delle biopsie in collagenasi e loro placcatura su un piatto di plastica nel terreno di coltura per consentire la crescita di C-MSC è descritto. Le cellule isolate possono essere espanse in coltura per diversi passaggi. Per confermare il loro fenotipo mesenchimale, viene fornita la descrizione di caratterizzazione immuno-fenotipica. C-MSC sono in grado di differenziarsi in diversi tipi cellulari come adipociti, condrociti e osteoblasti: nel contesto di ACM, caratterizzata da depositi del adipocyte nei cuori dei pazienti, i protocolli per la differenziazione di adipogenico del C-MSC e il caratterizzazione di accumulazione della gocciolina del lipido sono descritti.

Introduction

Cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule adulte con un’importante funzione di sostegno in molti tessuti1. Midollo osseo rappresenta la fonte storica di MSC, ma possono essere isolate da tessuti differenti compreso la placenta, tessuto adiposo, sangue del cordone ombelicale, fegato e cuore1,2.

Nel 2006, la società internazionale per la terapia cellulare (ISCT) specificato, per la prima volta, i criteri minimi per definire umano MSC3. In particolare, MSC deve avere la capacità di aderire alla plastica. Essi esprimono gli antigeni di superficie specifici: la positività per gli indicatori mesenchymal CD44, CD105, CD29 e CD90 e la negatività per CD14, CD45, CD34, CD31 ematopoietici ed endoteliali marcatori caratterizzano MSC. A causa dell’espressione di mancanza di HLA-DR, MSC sono in grado di innescare alloreactivity. Inoltre, essi sono cellule multipotenti con la capacità di differenziarsi verso adipogenico, condrociti e osteoblasti lignaggi1,3.

Concentrandosi sulla composizione cellulare cardiaca, cellule stromali mesenchimali cardiache (C-MSC) sono abbondanti in un cuore adulto normale4,5. Essi svolgono un ruolo critico sia nella funzione cardiaca normale e condizioni patologiche. Po, fisiologicamente, C-MSC forniscono un microambiente che supporta l’integrità strutturale e funzionale del miocardio, nelle malattie di cuore sono attivati in risposta alla lesione del cuore che partecipano nella guarigione delle ferite e fibrotica rimodellamento6 ,7.

Il coinvolgimento del C-MSC in sostituzione adiposa di aritmogenica cardiomiopatia (ACM) ha recentemente dimostrati8. In particolare, ACM è un disordine genetico principalmente causato da mutazioni in geni desmosomal che portano alla sostituzione di tessuto fibro-adiposo del miocardio, principalmente nel ventricolo destro9. Questa sostituzione, che si estende dall’epicardio all’endocardio, crea un substrato non-conduttivo che suscita insufficienza cardiaca progressiva e peggiora le aritmie ventricolari, che possono portare, in casi gravi, alla morte improvvisa. Sommariva et al. ha dimostrato l’origine mesenchimale dei pre-adipociti presenti nelle sezioni di cuore explanted dei pazienti ACM. Inoltre, C-MSC isolate da biopsie endomyocardial di geni ACM cuori espresso desmosomal e pertanto può essere influenzato da loro mutazioni. In particolare, in condizioni di adipogenico, ACM C-MSC si accumulano più lipidi rispetto a quelli da cuori di controllo. Questa evidenza porta alla conclusione che C-MSC sia avere un ruolo attivo nella patogenesi della malattia e rappresentano un modello di cella valido per lo studio di ACM.

Per facilitare la ricerca futura in questo contesto o in altre malattie cardiache per i quali è indicata una biopsia cardiaca, è presentato un protocollo dettagliato per l’isolamento del C-MSC da piccoli frammenti di tessuto endomyocardial, loro espansione, loro immuno-fenotipiche caratterizzazione e adipogenico differenziazione.

Protocol

Questo approccio è conforme alla dichiarazione di Helsinki e la raccolta di campioni ventricolare di destra è stato approvato (06/07/2012) dal comitato etico “Centro Cardiologico Monzino IRCCS”. 1. soluzioni Rendere il terreno TMES per la coltura di C-MSC con per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM), completati con 20% siero bovino fetale (FBS), fattore di crescita del fibroblasto base ng/mL 10, 10.000 U/mL penicillina, 10.000 µ g/mL streptomicina e 0,02 M L-glutammina. Filtrare il mezzo TMES utilizzando un filtro sterile da 0,22 µm e conservare a 4 ° C. Per preparare la soluzione di collagenasi, risospendere il mix di collagenasi NB4 in mezzo IMDM per ottenere una soluzione finale con una concentrazione di 3 mg/mL. Vortice delicatamente per sciogliere la polvere e filtrare la soluzione di collagenasi usando un filtro di siringa 0,2 µm. Volume di aliquota 1 mL in provette sterili da 2 mL e conservare a-20 ° C fino a quando necessario per l’uso. Per preparare il supporto di T. ADIPO, fare medium adipogenico con medie IMDM completati con 10% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (pre-diluito in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 0,5 M e conservati a-20 ° C fino all’utilizzo), idrocortisone 1 µM (pre-diluito in DMSO a 100 mM e ulteriormente diluito a 10 mM in sterile di acqua distillata e conservati a-20 ° C fino all’utilizzo) e l’indometacina 0.1 mM (pre-diluito in DMSO ad una concentrazione di 0,5 M e conservati a-20 ° C fino all’utilizzo). Filtrare il mezzo di T. ADIPO utilizzando un’unità di filtro sterile 0,22 µm e conservare a 4 ° C. Preparare il tampone di lavaggio composto da tampone fosfato salino 0,0067 M PO4 (PBS), Acido etilendiammina tetra acetico (EDTA) 5 mM e 5% di albumina di siero bovino e conservare a 4 ° C. Preparare olio rosso O (ORO) soluzione di lavoro di dissoluzione 1% polvere ORO in 60% isopropanolo, mescolando per 2 h e il filtro utilizzando un’unità di filtro da 0,22 µm per rimuovere precipitati. Conservare la soluzione di lavoro a temperatura ambiente (TA). 2. isolamento di cellule stromali mesenchimali cardiache Trattamento e la raccolta di biopsia cardiacaNota: prima di iniziare, assicurarsi di avere la soluzione di collagenasi e il mezzo TMES pronto. Mettere la biopsia endomiocardica ACM (solitamente circa 5 mg di tessuto) in una provetta sterile pieno di TMES e trasporto in laboratorio.Nota: Le biopsie ACM sono raccolti nella sala operatoria elettrofisiologia, secondo precedenti reports10. Brevemente, l’integrazione della mappatura electro-anatomico ed ecocardiografia intracardiaca nel ventricolo destro (Vedi Video 1) è usato per guidare la biopsia endomiocardica (Vedi Video 2, fluoroscopia) in corrispondenza alla zona di confine della miocardio malato. Campioni sani di controllo (HC) sono forniti da una bio-banca di tessuti, ottenuta dalla parete libera ventricolare di destra di donatori cadaverici entro 24 h della morte (morte accidentale, soggetti sani). Durante il trasporto e prima della dissezione, conservare la biopsia in TMES a 4 ° C. Limitare il tempo tra biopsia raccolta ed il trattamento del tessuto (max 24 h). Impostare la sicurezza biologica armadietto con soluzioni richieste per eseguire la procedura fino alla digestione enzimatica. Mettere lo sterilizzatore sotto il cofano e accendere lo strumento 15 min prima dell’uso, fino a quando la temperatura aumenta di 200-250 ° C. Sterilizzare le forbici e pinzette per 10 s. Make sicuro il strumenti sterilizzati sono freddi prima dell’uso. Preparare il bisturi sterile monouso. Posizionare i tubi con la biopsia nella cappa sterile. Aprire il tubo e trasferire la biopsia in una piastra sterile. Lavare la biopsia di ventricolo destro due volte con 3 mL di PBS sterile. Se si desidera scattare una foto della biopsia al microscopio. Trasferire la biopsia del ventricolo destro, con pinzette sterili, in una provetta sterile 2 mL contenente 1 mL della soluzione della collagenosi. Tagliare il campione in 0,5 – 1 mm3 pezzi con forbici sterili. Incubare per 1,5 h a 37 ° C in agitazione continua rotazione. Centrifugare la soluzione digerita a 400 x g per 10 minuti a TA. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di PBS sterile per lavare la pallina. Centrifuga a 400 x g per 10 min a RT. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno TMES. Piastra la sospensione ottenuta sulla piastra 60 mm sterili per coltura trattato e aggiungere mezzo TMES il volume finale da 3 mL. Incubare la piastra in un’incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C con 5% CO2.Nota: Un volume più alto del mezzo potrebbe impedire la corretta adesione di una frammenti digeriti biopsia. Dopo 24 h, eliminare il terreno per rimuovere detriti e cellule non aderenti.Nota: Singole cellule mesenchimali dissociate possono attaccare alla superficie plastica e dare origine a cloni; Inoltre, frammenti non digerito piccola biopsia possono allegare al piatto plastica e consentire cella germinazione. Lavare la piastra due volte con 5 mL di PBS sterile e aggiungere 3 mL di terreno nuovo TMES. Sostituire il mezzo TMES tre volte a settimana fino a quando le cellule sono 80% confluenti.Nota: Il numero di cellule allegate dipende la qualità, la quantità di tessuto e l’efficienza della digestione. 3. cellula espansione Nota: Prima di iniziare assicurarsi di avere TMES mezzo pronto. Quando le cellule sono 80% confluenti, trasferimento i digerito piccoli campioni bioptici in una nuova cultura di tessuto sterile di 60 mm trattati piatto e aggiungere 3 mL di terreno nuovo TMES.Nota: I campioni bioptici possono essere riutilizzati per l’ulteriore isolamento del C-MSC. È possibile ripetere questa procedura fino a quando c’è un numero significativo di cellule isolate. Lavare le cellule allegate due volte con 3 mL di PBS sterile. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA (0,5 mL per un piatto di 60 mm) e incubare a 37 ° C per 3-5 minuti consentire il distacco delle cellule. Quando le cellule si staccano dalla superficie della piastra, aggiungere 0,5 mL di FBS sterile per inattivare la tripsina e raccogliere le cellule in una nuova provetta sterile da 50 mL. Lavare la piastra due volte con 5 mL di PBS sterile per aggiungere le celle rimanenti al tubo stesso. Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 minuti a TA. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno TMES. Caricare 10 µ l di sospensione cellulare nella cella camera di conteggio.Nota: Se le celle sono troppo concentrate, diluire la sospensione iniziale 01:10 in PBS e caricare 10 µ l di cellule diluite nella cella camera di conteggio. Sotto il microscopio, contare le celle in 3 grandi piazze e sulle linee di due dei loro lati e calcolare il numero medio di cellule.Nota: Per ottenere il numero di cellule/mL, la media delle cellule contate è moltiplicata per 104, il fattore di diluizione della cella camera di conteggio. Se le cellule sono stati ulteriormente diluite, moltiplicare per il fattore di diluizione. Il rapporto tra il numero di cellulare da seme e concentrazione delle cellule (numero di cellule/mL) corrisponde al volume (in mL) di sospensione iniziale per essere placcato per il passo successivo (punto 3.9). Piastra la risospensione sulle piastre di coltura di tessuto sterile 100 mm trattato ad una concentrazione finale di 5.000-10.000 cellule/cm2 e aggiungere mezzo TMES il volume finale di 8 mL. Incubare la piastra in un’incubatrice di coltura cellulare.Nota: Ripetere la procedura di espansione delle cellule quando le cellule sono 70-80% confluenti. Ad ogni passaggio (P), si consiglia di crioconservare parte delle cellule e piastra l’importo rimanente. Espandere le cellule fino al P3 o P4 e utilizzare per analisi di cellule fluorescente-attivata del selezionatore (FACS) (sezione 4) e adipogenico differenziazione (sezione 5). Per la crioconservazione dopo distacco, centrifugare le cellule a 400 x g per 10 minuti a TA. Numero di celle come descritto (passaggi da 3,7-3,8) e risospenda 1 x 106 cellule a 900 µ l di FBS sterile. Trasferimento a cryo-flaconcino sterile e aggiungere 100 µ l di sterile DMSO e mescolare. Memorizzare velocemente il cryo-fiale in un contenitore di congelamento a-80 ° C per almeno 2 giorni e poi trasferire i flaconcini in azoto liquido. 4. caratterizzazione delle cellule stromali mesenchimali cardiache tramite flusso Cytometry Nota: Prima di iniziare, assicurarsi di avere il reagente di dissociazione delle cellule, buffer e gli anticorpi specifici preparati di lavaggio. Quando il numero di cellulare raggiunge almeno 3 x 106 (conteggio le celle come descritto in 3,7-3,8), lavare la piastra 100 mm due volte con 10 mL di PBS sterile. Aggiungere 5 mL di un reagente di dissociazione delle cellule e aspettare 7-10 min a RT per consentire il distacco delle cellule. Quando le cellule si staccano dalla superficie della piastra, aggiungere 15 mL di tampone di lavaggio sterile e raccogliere la sospensione in una nuova provetta sterile da 50 mL. Lavare la piastra due volte con 10 mL di tampone di lavaggio e aggiungere le celle rimanenti al tubo stesso. Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 min a RT e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio. Contare le celle come descritti (passi 3,7-3,8) e trasferire 3 x 106 cellule in una provetta sterile nuova e aggiungere il volume finale di 1,5 mL di tampone di lavaggio.Nota: Il numero totale delle cellule e il volume totale del tampone di lavaggio dipende dal numero di marcatori selezionati utilizzati per l’analisi (3 x 105 celle in 100 µ l per ogni provetta polistirolo FACS). Distribuire 100 µ l di sospensione cellulare in 12 diverse provette di polistirene FACS e aggiungere l’anticorpo specifico alla concentrazione indicata nel foglio dati del prodotto.Nota: Gli anticorpi utilizzati per la caratterizzazione di C-MSC sono CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 e HLA-DR (tabella 1). È importante preparare un campione di controllo composto da 100 µ l di sedimento cellule colorate con il controllo di isotipo per verificare la specificità del segnale. Incubare i campioni per 15 min al buio. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio sterile ad ogni provetta per arrestare la reazione. Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 minuti a TA. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 250 µ l di tampone di lavaggio. Procedere alla caratterizzazione di C-MSC con citometria a flusso. 5. adipogenico differenziazione delle cellule stromali mesenchimali cardiache Nota: Prima di iniziare, assicurarsi di aver preparato medio T. ADIPO e soluzione di lavoro di ORO. Cultura in medium ADIPO T. Staccare e contare le celle come descritto nella sezione 3. Piastra 3 x 105 cellule sul ciascun pozzetto di una cultura di tessuto 6 pozzetti sterile trattati piastra in 2 mL di terreno T. ADIPO. Lasciate che il C-MSC differenziare in mezzo T. ADIPO per 72 h o 1 settimana, cambiando mezzo ogni 2-3 giorni. Olio rosso O macchiaturaNota: uso olio rosso O (ORO) che macchia per testare l’accumulazione del lipido in C-MSC. Posizionare il plateunder di coltura del tessuto 6 pozzetti la cappa. Rimuovere il medium adipogenico e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere il sufficiente volume di paraformaldeide al 4% (PFA) per coprire ogni bene. Fissare le cellule per 5 minuti a TA. Scartare il PFA e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS. Incubare le cellule fisse con soluzione di lavoro di ORO per 1h a RT, utilizzo abbastanza volume per coprire ogni bene.Nota: Non tenere la piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti sotto la cappa durante l’incubazione di ORO per evitare l’evaporazione della soluzione di lavoro di ORO. Rimuovere tutte le soluzione di lavoro di ORO e lavare con 2 mL di PBS 3 – 5 volte fino a quando la piastra è completamente pulita; scartare i lavaggi. Interrompere i lavaggi quando il PBS utilizzato è chiaro e quando non vedete, al microscopio, non specifica colorazione fuori dalle celle. Catturare 20 immagini 20 ingrandimenti per ciascun pozzetto usando il microscopio a contrasto di fase invertita coltura del tessuto. Aprire le immagini con il programma di elaborazione immagini per quantificare la cella di accumulo di ORO. Separare i canali di colore diverso attraverso la funzione “split canali” al fine di quantificare solo la luminanza nel canale rosso-255. Contare il numero di celle per ogni immagine contando i nuclei. Normalizzare l’intensità del segnale ORO al numero di cellulare. Calcolare la media dei risultati ottenuti per ogni immagine del campione stesso.

Representative Results

Cardiaco stromal cells isolamento: L’isolamento di C-MSC dalla procedura di biopsia endomiocardica è riassunto nella Figura 1. Cardiaco stromal cells mesenchimali caratterizzazione: Come stabilito dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT), i criteri minimi per la definizione di cellule stromali mesenchimali multipotenti include loro caratterizzazione immuno-fenotipica3. In particolare, per confermare il loro lignaggio mesenchimale, cellule sono incubate con anticorpi FITC, PE, APC-coniugato appropriati e analizzate tramite flusso cytometry. Tutti gli anticorpi utilizzati nella caratterizzazione C-MSC sono elencati in Tabella materiali. Come illustrato nella Figura 2, C-MSC ottenuti dalle biopsie sono positive per gli antigeni di superficie mesenchymal specifici CD29, CD44 e CD105. La percentuale di cellule positive CD90 è variabile, come riferito precedentemente11. Endoteliale (CD31, CD34), monociti/macrofagi (CD14), ematopoietiche (CD45) marcatori e complesso maggiore di istocompatibilità (HLA-DR) non sono espressi (Figura 2). La differenziazione cellule stromali mesenchimali adipogenico cardiaco: Per richiedere la loro differenziazione adipogenico, devono essere coltivate in mezzo T. ADIPO C-MSC ottenuti da pazienti affetti da ACM e HC (Vedi sezione soluzioni). Le cellule sono mantenute in coltura per 72 h o 1 settimana, sostituendo il mezzo due volte a settimana. L’accumulazione delle goccioline del lipido intracellulare è testimoniata dal ORO colorazione (Figura 3). Differenze nella capacità, ma anche nel grado di differenziazione, possono essere osservate tra le cellule ottenute da ACM e HC. Come mostrato nelle immagini rappresentative, ACM C-MSC si accumula più gocce lipidiche di HC C-MSC dopo 72 h di cultura in medium adipogenico (Figura 3). Queste differenze sono mantenute anche quando le cellule sono esposte a condizioni di differenziazione adipogenico per un periodo più lungo (1 settimana) (Figura 3). Video 1: Integrazione di ecocardiografia intracardiaca e mappa elettroanatomico. Endocardial elettroanatomico unipolare mappe del ventricolo destro (sinistro anteriore oblique e anteriore di destra le viste oblique) in un paziente che subisce la biopsia endomiocardica (pannelli inferiori). Alcune aree di bassa tensione (rosso/verde) sono visibili all’apice. Campioni bioptici endomyocardial (etichettati come cerchio) sono raccolti in corrispondenza al miocardio malato e setto interventricular. L’ecocardiografia intracardiaca in tempo reale permette di verificare la corretta posizione del bioptome presso l’area di destinazione (pannello superiore). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.) Video 2: video di radioscopia in vista obliqua anteriore di destra. Il bioptome viene inserito attraverso una guaina lunga-orientabile e avanzata nel ventricolo. Dopo un’attenta verifica del contatto bioptome con il miocardio, le ganasce sono aperto e quindi saldamente chiuso per raccogliere il campione. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.) Figura 1: progetto procedura. Il campione bioptico endomyocardial raccolti utilizzando un catetere bioptome, uno strumento di piccolo taglio a forma di tenaglia. Il peso della biopsia ottenuta è di circa 5 mg (A). Il campione bioptico endomyocardial è macinato in 0,5 – frammenti di3 di 1 mm, con forbici sterili (B), e viene aggiunta la soluzione della collagenosi. Il campione viene posto in un incubatore a 37 ° C su un mixer a piattaforma rotante per 1,5 h di digestione (C). La soluzione digerita è centrifugata e placcata in TMES in un piatto di plastica (D). C-MSC sono ottenuti grazie alle loro proprietà di adesione plastica in singole cellule o cloni o che spuntano da piccoli frammenti bioptici non digeriti (E). C-MSC sono quindi caratterizzati da citometria a flusso (F). C-MSC sono placcati in mezzo adipogenico ed accumulazione della gocciolina del lipido è testata da Oil Red O macchiatura (G). Barre della scala indicano 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: rappresentante cyto-fluorimetrica profilo del C-MSC. Ogni istogramma mostra il conteggio delle cellule contro l’intensità di fluorescenza nel canale indicato (PE: ficoeritrina; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescina-isothyocyanate). In ogni grafico il controllo di isotipo (bianco) e un campione coniugati con la cella specifica dell’anticorpo di superficie dell’indicatore (rosso) sono mostrati. C-MSC sono positivi per antigeni superficiali mesenchymal CD29, CD44, CD105 e, parzialmente, CD90, considerando che non esprimono CD31, CD34, CD14, CD45 e HLA-Dr. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: adipogenico differenziazione del C-MSC. Immagini rappresentative di ACM e HC C-MSC, coltivate in medium adipogenico per 72 h e 1 settimana, macchiato con ORO (foto sinistra; n = 3). Nei grafici di destro, è segnalata la quantificazione della luminanza della colorazione rosso-255 canali: intensità è espressa in unità arbitrarie (UA). ACM C-MSC si accumulano più goccioline del lipido che i comandi. È stato utilizzato il test T di Student, *: p < 0.05. Barre della scala indicano 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

MSC e C-MSC: MSC sono cellule multipotenti residente nella frazione stromal di diversi tessuti adulti, quali midollo osseo, tessuto adiposo, cartilagine, cervello, pelle, allegati fetali e cuore12. Diversi studi sono stati condotti per isolare e caratterizzare il loro per le potenziali applicazioni nella ricerca di base e traslazionale12,13.

In buone condizioni di salute, MSC sono quiescenti, autorinnovabile a tassi bassi14. Dal momento che sono esposti ai cambiamenti patologici ambientali, reagiscono rimodellamento tissutale favorendo attraverso transdifferenziazione diretta, la deposizione di matrice o l’ effetto di paracrine14.

La MSC cardiaco (C-MSC) rappresentano una popolazione di cellule di grandi dimensioni non-myocyte del cuore4. Essi provengono dall’epicardio e migrano nel miocardio che subiscono il processo di transizione epiteliale-mesenchimale15. Essi contribuiscono all’integrità meccanica ed elettrica della struttura cardiaca, sia in fisiologico e in stati patologici, attraverso interazioni con cardiomiociti e matrice extracellulare omeostasi7,16. Tuttavia, le funzioni di vasta gamma di C-MSC è ancora non completamente capito. Una conoscenza più approfondita del loro ruolo che sia in condizioni fisiologiche e patologiche può essere facilitate da studi in vitro effettuati dopo il loro isolamento.

C-MSC sono stati ottenuti da diversi distretti del cuore umano, come l’annesso atriale2,17 e il ventricolo destro18.

Recentemente, C-MSC da campioni bioptici umani endomyocardial ventricolare di destra sono state ricavate8, dimostrando che il tessuto di origine potrebbe essere minimo di 3-5 mg.

Possibili applicazioni: Il metodo descritto in questo manoscritto permette di ottenere celle con alcuni semplici passaggi, come selezione per plastica aderenza e la digestione da esemplari molto piccolo cuore.

C-MSC può essere considerato un modello di cellulare, poiché sono facili da amplificare e mantenere in vitroe sono in grado di differenziarsi in cellule di derivazione mesenchimale (endotelio, osteociti e adipociti). Inoltre, la possibilità di ottenere cellule direttamente dai pazienti costituisce uno strumento di grande in vitro per studi meccanicistici nel contesto della medicina personalizzata/precisione. Infatti, queste cellule trasportano il background genetico e alla fine specifiche mutazioni dei donatori e sono influenzate dalle caratteristiche specifiche dei pazienti, quali condizioni cliniche, età, sesso, stile di vita e farmaci. Inoltre, la possibilità di ordinandoli per differenti marcatori può consentire lo studio di specifiche C-MSC sottoinsiemi19.

C-MSC sono noti per essere soggetti attivi nelle diverse malattie cardiovascolari, principalmente caratterizzate da avverse rimodellamento del cuore. Pertanto, essi rappresentano possibili bersagli per nuove strategie terapeutiche contrastare malattie cardiache8,20.

Proprietà simil-staminali C-MSC e la loro mancanza di immunogenicità significativo suggerisce la loro potenziale applicazione in terapia cellulare per la medicina rigenerativa cardiaca. Infatti, come MSC da midollo osseo o da altre fonti, C-MSC potrebbero essere utilizzati sia in autologo allogenico impostazioni, senza la necessità per la corrispondenza tra donatore e destinatario21.

Inoltre, C-MSC, essendo isolato direttamente dal tessuto del cuore, hanno il vantaggio di essere condizionato dal microambiente cardiaco e profilo epigenetico. Nell’ambito della medicina rigenerativa cardiaca, questo potrebbe essere particolarmente importante per ottenere risultati di successo.

Ad oggi, studi preclinici di medicina rigenerativa identificato potenziale terapeutico utile in C-MSC e loro paracrine attività18,22,23. Importante, studi clinici in cui l’origine delle cellule è il cuore sono in corso sia con cellule derivate cardiosfere sottopopolazioni di C-MSC13,24,25. Tuttavia, per quanto riguarda MSC osso-zucchino-derivate, protocolli diversi possono essere necessari per ottenere il grado clinico C-MSC26.

C-MSC in ACM: Il protocollo presentato principalmente è adatto per lo studio delle patologie per le quali è indicata una biopsia endocardica. ACM pazienti subiscono bioptici procedure per scopi diagnostici27. Loro miocardio viene gradualmente sostituito da tessuto cicatriziale, un tessuto elettricamente inerte composto di adipociti e fibrosi. Al fine di guidare il campionamento bioptico alla zona della cicatrice, dove il rendimento diagnostico è massimo, endomyocardial mapping è usato10,28,29. I campioni utilizzati in questo protocollo sono presi nella zona di confine del miocardio malato.

Sommariva et al ha recentemente definito un ruolo fondamentale di C-MSC nella patogenesi di ACM8, dimostrando che la C-MSC sono giocatori attivi in ACM cuore adipogenesis, poiché preadipociti in quei cuori sono di origine mesenchimale. Inoltre, C-MSC isolato con il presente protocollo da biopsie di pazienti ACM ha mostrato più propensione all’accumulo di lipidi e di adipogenesis rispetto ai controlli. Per questo motivo, queste cellule potrebbero essere utilizzate per confermare alcuni dei meccanismi molecolari di ACM, dimostrando la loro idoneità come un modello di cellulare per studi meccanicistici9.

Limiti e fasi critiche: Nonostante i vantaggi di ottenere C-MSC direttamente dai pazienti (Vedi il paragrafo “Possibili applicazioni”), il presente protocollo è sottoposto a limitazioni diverse.

Prima di tutto, la procedura bioptica cardiaca è invasiva e spesso evitato se non strettamente necessario. Infatti, il campionamento del tessuto cardiaco è sia eticamente e tecnicamente problematico. Motivi per eseguire una biopsia cardiaca possono essere il raggiungimento di una diagnosi definita nel contesto delle cardiomiopatie nella diagnosi differenziale, monitoraggio dello stato dei trapianti cardiaci, o accertare la presenza di un tumore di cuore30. Di conseguenza, solo i pazienti per cui è indicata una biopsia endomyocardial di consenso istruzione31 possono essere iscritti per la ricerca sul C-MSC. Inoltre, la procedura bioptica cardiaca può avere complicazioni cliniche, soprattutto nei cuori cardiomyopathic. Di conseguenza, campionature di elettrofisiologo sono sempre caute e campioni bioptici potrebbero essere molto piccoli, compromettere l’isolamento di cellule. Gli esperimenti futuri potrebbero superare questo problema di ottimizzazione concentrazione di collagenasi o tempi di digestione.

C-MSC, come tutte le cellule umane primarie, mostrano un’alta variabilità tra i diversi soggetti in tutti i fenotipi. Infatti, cellule da diversi soggetti sono non solo geneticamente differenti, ma anche sottoposti a condizionamento ambientale variabile. In particolare, all’interno di questo esperimento, si osserva un’alta variabilità nel differenziamento cellulare adipogenico, crescita e isolamento.

Fasi critiche del presente protocollo devono essere riconosciuti. Se il campione bioptico include capillari, essi devono essere rimossi per evitare l’isolamento parallelo delle cellule endoteliali, che potrebbero contaminare la cultura C-MSC e può essere evidenziato dall’analisi FACS (positività per CD31). Per ottenere un’efficiente adipogenico differenziazione, le cellule devono essere in una fase di crescita attiva. Il grado di confluenza può anche influenzare l’accumulo di lipidi.

Significato del metodo: Rispetto ai precedenti metodi di isolamento di cellule stromali mesenchimali, questa è la prima volta dove la descrizione di ottenimento di C-MSC direttamente da campioni bioptici ventricolari umani è proposto in dettaglio. Anche se questo metodo è suggerito per il trattamento dei campioni di pazienti di ACM, è potenzialmente applicabile a tutti i pazienti per i quali è indicata una biopsia cardiaca.

Questo protocollo rappresenta un’implementazione utile dei precedenti metodi per l’ottenimento di cellule che ha richiesto grandi campioni cardiaco32, che sono spesso difficili da raccogliere.

Inoltre, la sorgente campione costituisce un’innovazione interessante. Mentre la biopsia ventricolare viene solitamente eseguita sul setto33, questo protocollo prende in considerazione campioni ottenuti dalla parete libera ventricolare di destra. Le cellule derivate dal quartiere ventricolare destra malato possono essere più rappresentativi dello stato patologico di malattie che coinvolgono RV.

Inoltre, alcuni dei reagenti utilizzati nel presente protocollo sono diversi per quanto riguarda altri C-MSC isolamento e la differenziazione metodi32. Ad esempio, il tipo di collagenasi proposto in questo manoscritto è un mix di classe I e classe collagenasi II con un rapporto equilibrato di attività proteolitica. Inoltre, la soluzione di digestione è composto il mix di collagenasi dissolto nello stesso mezzo basale (IMDM) utilizzato per la preparazione del terreno di coltura di C-MSC, permettendo isolato C-MSC di adattarsi alle condizioni di crescita futura.

Inoltre, anche se l’ordinamento procedure potrebbe standardizzare il batch di cella, utilizzando l’intera popolazione di C-MSC, isolati solo attraverso la proprietà di aderenza plastica di queste cellule, costituisce una semplificazione senza alterare la immunophenotypic caratteristiche di C-MSC. La composizione del T. ADIPO proposto in questo manoscritto è in grado di condurre alla differenziazione adipogenico, evitando l’alterazione metabolica indotta da altri componenti come l’insulina.

Inoltre, il metodo proposto di quantificazione di accumulo dei lipidi, che si basa sulla valutazione dell’intensità colorimetrica ORO, fornisce ulteriori informazioni circa la quantità di lipidi accumulati, se confrontato con metodi basati solo sulla percentuale delle cellule positive per la macchiatura di ORO. Spesso l’accumulazione del lipido è quantificato estraendo l’ORO incorporato dalle cellule con isopropanolo e misurare l’assorbanza. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi ed è soggetto a variabilità dovuta all’evaporazione di isopropanolo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della salute, Ricerca Corrente al Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materials

IMDM Gibco by Life Technologies  12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
PENICILLIN STREPTOMYCIN Life Technologies Italia 15140122
Collagenase NB4 Serva 17454.02
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B
L-glutammine Sigma-Aldrich G7513
PBS Lonza 17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) Gibco 12563029
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Trypsin-EDTA solution  Sigma-Aldrich T6689
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS D.b.a. Italia S.r.l. sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855
Antibody CD14-FITC (MφP9) Becton Dickinson 345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) Becton Dickinson 561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11) R&D Systems FAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) Thermo Fisher Scientific  CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26) Becton Dickinson 561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) Thermo Fisher Scientific MHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) Becton Dickinson 561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) Becton Dickinson 562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizer Gima  35642
Bench centrifuge Sigma 3-16K Sigma Centrifuges 10330
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific  5100-0001
AxioVert 200M microscope  Zeiss B 40-080 e 03/01
FACS Gallios Beckman Coulter  773231AF
ImageJ (image processing program) NIH
Stericup filter units Merck S.P.A.  SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mL Eppendorf 30122178
Conical Tubes, 15 mL Eppendorf 30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430167
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430166
6 well TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Falcon 352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk Sigma-Aldrich BR719520
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Pilato, C. A., Stadiotti, I., Maione, A. S., Saverio, V., Catto, V., Tundo, F., Dello Russo, A., Tondo, C., Pompilio, G., Casella, M., Sommariva, E. Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients. J. Vis. Exp. (132), e57263, doi:10.3791/57263 (2018).
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