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Developmental Biology

Isolement et caractérisation de cardiaques cellules stromales mésenchymateuses d’endomyocardique Bioptic échantillons de Patients de la cardiomyopathie arythmogène

Published: February 28, 2018
doi:
10.3791/57263
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1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health,Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center,Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

Summary

Dans cet article, une méthode pour isoler les cellules stromales mésenchymateuses cardiaques endomyocardique bioptic échantillons de patients cardiomyopathie arythmogène est fournie. Leur caractérisation et le protocole pour renforcer leur différenciation adipocytaire sont décrits.

Abstract

Un coeur adult normal est composé de plusieurs types de cellules différentes, parmi lesquelles les cellules stromales mésenchymateuses cardiaques représentent une population abondante. L’isolement de ces cellules offre la possibilité d’étudier leur implication dans des maladies cardiaques et, en outre, fournit un modèle utile cellulaires primaires afin d’étudier les mécanismes biologiques.

Ici, la méthode d’isolement de C-MSC d’échantillons bioptic des patients de la cardiomyopathie arythmogène est décrite. Les prélèvements de biopsie endomyocardique sont guidé dans les zones ventriculaires droite adjacentes à la cicatrice visualisée par cartographie electro-anatomiques. La digestion des biopsies dans la collagénase et leur placage sur un plat en plastique dans le milieu de culture pour permettre la croissance de C-MSC est décrite. Les cellules isolées peuvent être étendus en culture pour plusieurs passages. Pour confirmer leur phénotype mésenchymateuse, la description de caractérisation immuno-phénotypique est fournie. C-MSC sont capables de se différencier en plusieurs types de cellules comme les adipocytes, les chondrocytes et les ostéoblastes : dans le contexte de l’ACM, caractérisée par des dépôts d’adipocytes dans les coeurs des patients, les protocoles pour la différenciation adipocytaire de C-MSC et le caractérisation de l’accumulation de gouttelettes de lipides sont décrites.

Introduction

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules adultes avec une fonction de soutien importante dans de nombreux tissus1. Moelle osseuse représente la source historique du SMC, mais ils peuvent être isolés de différents tissus, y compris le placenta, le tissu adipeux, sang de cordon, foie et coeur1,2.

En 2006, la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT) spécifié, pour la première fois, les minimales critères permettant de définir les humains MSC3. En particulier, le CSM doit avoir la capacité d’adhérer au plastique. Ils expriment les antigènes de surface spécifiques : la positivité pour marqueurs mésenchymateux CD44, CD105, CD29 et CD90 et la négativité pour CD14, CD45, CD34, marqueurs de hématopoïétiques et endothéliales CD31 caractérisent MSC. En raison de l’expression manque de HLA-DR, MSC sont incapables de déclencher alloreactivity. De plus, ils sont des cellules multipotentes susceptibles de se différencier vers adipocytaire, chondrocyte et ostéoblastes lignées1,3.

En se concentrant sur la composition cellulaire cardiaque, cellules stromales mésenchymateuses cardiaques (C-SMC) abondent dans un coeur adulte normal4,5. Ils jouent un rôle essentiel dans la fonction cardiaque normale et pathologies. Alors que, physiologiquement, C-SMC fournissent un micro-environnement qui prend en charge l’intégrité structurelle et fonctionnelle du myocarde, maladies cardiaques, ils sont activés en réponse à une lésion cardiaque participant à la guérison des plaies et fibreuses remodelage6 ,,7.

Récemment, la participation de C-MSC en substitution adipeuse d’arythmogène cardiomyopathie (ACM) a été démontrée8. En particulier, ACM est une maladie génétique, principalement causée par des mutations dans les gènes de desmosomes qui mènent à myocardique remplacement fibro-gras, principalement dans le ventricule droit9. Cette substitution, qui s’étend de l’épicarde à l’endocarde, crée un non-conducteur substrat qui provoque une insuffisance cardiaque progressive et aggrave les arythmies ventriculaires, qui peuvent entraîner, dans les cas graves, à la mort soudaine. Sommariva et al. démontré l’origine mésenchymateuse des pré-adipocytes présents dans les sections de cœur explanté patients ACM. En outre, C-MSC isolés de biopsies endomyocardique des gènes de desmosomes express ACM coeurs et peut donc être affectée par leurs mutations. En particulier, dans des conditions adipocytaire, ACM C-MSC s’accumulent plus de lipides que ceux des coeurs témoins. Cette preuve permet de conclure que C-MSC ont un rôle actif dans la pathogenèse de la maladie et représente un modèle de cellule valide pour étudier les ACM.

Afin de faciliter les recherches futures dans ce contexte ou dans d’autres maladies cardiaques pour lesquels une biopsie cardiaque est indiquée, un protocole détaillé est présenté pour l’isolement de C-MSC de petits fragments de tissu myocardique, leur expansion, leur immuno-phénotypiques la caractérisation et la différenciation adipocytaire.

Protocol

Cette approche est conforme à la déclaration d’Helsinki et la collecte d’échantillons ventriculaires droite a été approuvé (06/07/2012) par le Comité d’éthique « Centro Cardiologico Monzino IRCCS ». 1. les solutions Faire eut médium pour la culture de la C-MSC avec le médium de Dulbecco modifiée de Iscove (IMDM), additionné de 20 % sérum bovin fœtal (SVF), facteur de croissance de 10 ng/mL basique des fibroblastes, 10 000 U/mL de pénicilline, 10 000 µg/mL de streptomycine et 0,02 M L-Glutamine. Filtrer le milieu eut à l’aide d’une unité de filtration stérile de 0,22 µm et conserver à 4 ° C. Pour préparer la solution de collagènase, remettre en suspension le mélange de collagénase NB4 dans un milieu IMDM pour obtenir une solution finale avec une concentration de 3 mg/mL. Vortex doucement pour dissoudre la poudre et filtrer la solution de la collagénase à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm. Volume aliquote de 1 mL dans des tubes stériles de 2 mL et conserver à-20 ° C jusqu’au moment de l’utilisation. À préparer ADIPO T. milieu, faire adipocytaire médium médium IMDM additionné de 10 % FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (préalablement dilué dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 0,5 M et conservés à-20 ° C jusqu’à l’utilisation), hydrocortisone 1 µM (préalablement dilué de l’eau distillée dans le DMSO à 100 mM et plus dilué à 10 mM en stérile et conservé à-20 ° C jusqu’à l’utilisation) et 0,1 mM l’indométhacine (préalablement dilué dans le DMSO à une concentration de 0,5 M et conservés à-20 ° C jusqu’à l’utilisation). Filtrer le milieu ADIPO T. à l’aide d’une unité de filtre stérile 0,22 µm et conserver à 4 ° C. Préparer le tampon de lavage composée de tampon phosphate salin 0,0067 M PO4 (PBS), l’acide éthylènediamine tétra acétique (EDTA) 5 mM et 5 % d’albumine sérique bovine et conserver à 4 ° C. Préparer l’huile rouge O (ORO) solution en dissolvant 1 % poudre ORO en 60 % isopropanol, mélanger pendant 2 h et filtrage à l’aide d’un filtre de 0,22 µm pour supprimer des précipités. Stocker la solution de travail à température ambiante (RT). 2. isolement de cellules stromales mésenchymateuses cardiaques Traitement et collecte de biopsie cardiaqueRemarque : avant de commencer, assurez-vous que vous disposez de la solution de la collagénase et le milieu eut prêt. Mettre la biopsie endomyocardique ACM (habituellement environ 5 mg de tissu) dans un tube stérile rempli d’eut et de le transporter au laboratoire.Remarque : Biopsies de l’ACM sont recueillis dans la salle d’électrophysiologie, selon les précédents rapports10. En bref, l’intégration de la cartographie electro-anatomique et échocardiographie intracardiaque dans le ventricule droit (voir la vidéo 1) est utilisée pour guider la biopsie endomyocardique (voir la vidéo 2, fluoroscopie) en face de la zone frontalière de la myocarde malade. Des échantillons de contrôle (SC) en bonne santé sont fournis par une bio-Banque de tissus, obtenue à partir de la paroi ventriculaire droite libre de cadavres dans les 24 heures du décès (mort accidentelle, sujets sains). Pendant le transport et avant la dissection, stocker la biopsie eut à 4 ° C. Limiter le délai entre le prélèvement de la biopsie et traitement de tissu (max 24h). Mettre en place la sécurité biologique du cabinet avec les solutions requises pour effectuer la procédure jusqu’à la digestion enzymatique. Mettre le stérilisateur sous le capot et allumez l’appareil 15 min avant de l’utiliser jusqu’à ce que la température s’élève à 200-250 ° C. Stériliser les ciseaux et pinces pour 10 s. Assurez-vous bien sûr les instruments stérilisés sont froids avant utilisation. Préparer les bistouris stériles jetables. Placer les tubes avec la biopsie dans la hotte stérile. Ouvrir le tube et transférer la biopsie dans un plateau stérile. Laver la biopsie du ventricule droit deux fois avec 3 mL de PBS stérile. Si vous voulez prendre une photo de la biopsie au microscope. Transférer la biopsie du ventricule droit, utilisez des pinces stériles, dans un tube stérile 2 mL contenant 1 mL de la solution de la collagénase. Couper l’échantillon en 0,5 – 1 mm3 morceaux avec des ciseaux stériles. Incuber pendant 1,5 h à 37 ° C sous agitation rotative continue. Centrifuger la solution digérée à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant et ajouter 1 mL de PBS stérile pour laver le culot. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu d’eut. Plaque de la suspension obtenue sur plaque stérile vitroplants de 60 mm traité et moyen eut s’ajoute le volume final de 3 mL. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2.Remarque : Un volume plus élevé de support peut-être empêcher l’adhérence correcte d’un fragments de biopsie digérée. Après 24h, jeter le moyen pour enlever les débris et les cellules non adhérentes.Remarque : Des cellules mésenchymateuses dissociées unique peuvent fixer à la surface en plastique et donner lieu à clones ; aussi, des fragments non digérés petite biopsie peuvent fixer sur le plat en plastique et permettent la germination de la cellule. Laver la plaque deux fois avec 5 mL de PBS stérile et ajouter 3 mL de milieu frais d’eut. Remplacer le milieu eut trois fois par semaine jusqu’à ce que les cellules sont 80 % anastomosé.Remarque : Le nombre de cellules attachées dépend de la qualité, la quantité de tissu et sur l’efficacité de la digestion. 3. Expansion des cellules Remarque : Avant de commencer Assurez vous d’avoir moyen eut prêt. Lorsque les cellules sont confluentes, transfert de 80 % les échantillons bioptic petits digérées dans une nouvelle culture de tissu de 60 mm stérile traitement plaque et ajouter 3 mL de milieu frais d’eut.Remarque : Les échantillons bioptic peuvent être réutilisées pour plus C-MSC d’isolation. Il est possible de répéter cette procédure jusqu’à ce qu’il y a un nombre important de cellules isolées. Laver les cellules attachées deux fois avec 3 mL de PBS stérile. Ajouter la solution de trypsine-EDTA (0,5 mL pour un plat de 60 mm) et incuber à 37 ° C pendant 3-5 min permettre le détachement de la cellule. Lorsque les cellules sont détachés de la surface de la plaque, ajouter 0,5 mL de FBS stérile pour inactiver la trypsine et de prélever des cellules dans un nouveau tube de 50 mL stérile. Laver la plaque deux fois avec 5 mL de PBS stérile d’ajouter les cellules restantes dans le même tube. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu d’eut. Charger de 10 µL de la suspension cellulaire dans la cellule chambre de comptage.Remarque : Si les cellules sont trop concentrées, diluer la suspension initiale 01:10 dans du PBS et 10 µL de cellules dilués dans la cellule de comptage chambre de charge. Sous le microscope, compter les cellules dans 3 grands carrés et sur les lignes de deux de leurs côtés et calculer le nombre moyen de cellules.Remarque : Pour obtenir le nombre de cellules/mL, la moyenne de cellules comptées est multipliée par 104, le facteur de dilution de la cellule de comptage chambre. Si les cellules ont été plus dilués, multiplier le facteur de dilution. Le rapport entre le nombre de cellules pour amorcer et la concentration de cellules (nombre de cellules/mL) correspond au volume (en mL) de suspension initiale d’être plaqué pour la prochaine étape (point 3.9). Plaque de la remise en suspension sur des plaques de vitroplants stérile 100 mm traités à une concentration finale de 5 000-10 000 cellules/cm2 et moyen eut s’ajoute le volume final de 8 mL. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire.Remarque : Répéter la procédure d’extension de cellule lorsque les cellules sont confluents de 70 à 80 %. À chaque passage (P), il est recommandé de cryopréserver partie des cellules et plaque le montant restant. Développez les cellules jusqu’à P3 ou P4 et utiliser pour les cellules fluorescentes trieuse (FACS) analyse (section 4) et la différenciation adipocytaire (section 5). Pour la cryoconservation après détachement, centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Cellules de numération comme décrivent (étapes 3,7 à 3,8) et remettre en suspension 1 x 106 cellules dans 900 µL de FBS stérile. Transfert à un cryo-flacon stérile et ajouter 100 µL de stérile DMSO et mélanger. Stocker rapidement les cryo-flacons dans un récipient de congélation à-80 ° C pendant au moins 2 jours et ensuite transférer les flacons dans l’azote liquide. 4. caractérisation des cardiaques cellules stromales mésenchymateuses par cytométrie en flux Remarque : Avant de commencer, assurez vous d’avoir le réactif de dissociation cellulaire, lavage de tampon et les anticorps spécifiques préparés. Lorsque le nombre de cellules est au moins 3 x 106 (nombre de cellules comme décrit dans 3,7 à 3,8), laver la plaque de 100 mm deux fois avec 10 mL de PBS stérile. Ajouter 5 mL d’un réactif de dissociation cellulaire et attendre 7 à 10 min à ta pour permettre le détachement de la cellule. Lorsque les cellules sont détachés de la surface de la plaque, ajouter 15 mL de tampon de lavage stérile et recueillir la suspension dans un nouveau tube de 50 mL stérile. Laver la plaque deux fois avec 10 mL de tampon de lavage et ajouter le reste des cellules d’un même tube. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à RT et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lavage. Compter les cellules comme décrits (étapes 3,7 à 3,8) et 3 x 106 cellules de transfert dans un nouveau tube stérile et ajoute le volume final de 1,5 mL de tampon de lavage.Remarque : Le nombre total de cellules et le volume total de mémoire tampon de lavage dépend du nombre de marqueurs sélectionnés pour l’analyse (3 x 105 cellules dans 100 µL de chaque tube en polystyrène de FACS). Distribuer 100 µL de la suspension cellulaire dans 12 tubes en polystyrène de différentes FACS et ajoutez l’anticorps spécifique à la concentration indiquée dans la fiche produit.Remarque : Les anticorps utilisés pour la caractérisation de C-MSC sont CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 et HLA-DR (tableau 1). Il est important de préparer un échantillon de contrôle composé de 100 µL de cellules resuspendues colorées avec le contrôle de l’isotype à vérifier la spécificité du signal. Incuber les échantillons pendant 15 min dans le noir. Ajouter 1 mL de tampon de lavage stérile dans chaque tube pour arrêter la réaction. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 250 µL de tampon de lavage. Procéder à la caractérisation de C-MSC par cytométrie en flux. 5. adipocytaire différenciation des cellules stromales mésenchymateuses cardiaques Remarque : Avant de commencer, assurez-vous qu’a préparé les moyen de T. ADIPO et solution d’ORO. Culture dans un milieu ADIPO T. Détacher et compter les cellules tel que décrit à l’article 3. Plaque 3 x 105 cellules sur chaque puits d’une culture de tissu de 6 puits stérile traitées plaque dans 2 mL de milieu de T. ADIPO. Laissez C-MSC se différencient dans le milieu de T. ADIPO pendant 72 heures ou 1 semaine, évolution moyenne tous les 2-3 jours. Coloration de l’huile rouge ORemarque : utilisation huile rouge O (ORO) coloration pour tester l’accumulation de lipides dans C-MSC. Placer la culture de tissu de 6 puits plateunder la hotte. Retirez le support adipocytaire et laver les cellules deux fois avec 2 mL de PBS. Ajouter le volume suffisant de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour couvrir chaque bien. Fixer les cellules pendant 5 min à température ambiante. Jeter les PFA et laver les cellules deux fois avec 2 mL de PBS. Incuber les cellules fixes avec la solution de travail ORO pendant 1 h à RT, à l’aide de volume suffisant à couvrir chacun bien.Remarque : Ne gardez pas la plaque de culture de tissu de 6 puits sous la hotte pendant l’incubation de ORO pour éviter l’évaporation de la solution de travail de ORO. Enlever toutes les solution de travail ORO et laver avec 2 mL de PBS 3 – 5 fois jusqu’à ce que la plaque est complètement nettoyée ; jeter les lavages. Arrêter les lavages lorsque le PBS utilisé est clair et que vous ne voyez pas, sous le microscope, non-spécifique coloration hors des cellules. Capturer des 20 images à un grossissement de X 20 pour chaque puits à l’aide du microscope à contraste de phase inversé vitroplants. Ouvrir les images avec le programme de traitement d’image pour quantifier la cellule accumulation d’ORO. Séparer les couches de couleur différente par le biais de la fonction « split canaux » afin de chiffrer uniquement la luminance dans le canal rouge-255. Compter le nombre de cellules pour chaque image en comptant les noyaux. Normaliser l’intensité du signal ORO sur le nombre de cellules. Calculer la moyenne des résultats obtenus pour chaque image du même échantillon.

Representative Results

Isolement des cellules stromal cardiaque : L’isolement de C-MSC de procédure biopsies endomyocardique est résumée dans la Figure 1. Cardiaque stromal mésenchymateuse caractérisation de cellules : Tel qu’établi par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT), les critères minimaux pour définir les cellules stromales mésenchymateuses multipotentes comprend leur caractérisation phénotypique immuno3. En particulier, pour confirmer leur lignée mésenchymateuse, les cellules sont incubées avec des anticorps conjugué FITC/PE/APC appropriés et analysés par cytométrie en flux. Tous les anticorps utilisés pour la caractérisation de C-MSC sont répertoriés dans la Table des matières. Tel qu’illustré à la Figure 2, C-MSC obtenu à partir des biopsies sont positives pour les antigènes de surface mésenchymateuses spécifiques CD29 CD44 et CD105. Le pourcentage de cellules positives CD90 est variable, comme indiqué précédemment11. L’endothélium (CD31, CD34), monocytes/macrophages (CD14), hématopoïétiques (CD45) marqueurs et complexe majeur d’histocompatibilité (HLA-DR) ne sont pas exprimées (Figure 2). Différenciation cardiaque adipocytaire des cellules stromales mésenchymateuses : Pour inviter leur différenciation adipocytaire, C-MSC obtenu de patients touchés par ACM et SC doivent être cultivées dans un milieu ADIPO T. (voir la section Solutions). Les cellules sont maintenues en culture pour 72 h ou 1 semaine, remplaçant le milieu deux fois par semaine. L’accumulation de gouttelettes de lipides intracellulaires témoigne de ORO coloration (Figure 3). Peut constater des différences dans la capacité, ainsi que dans le degré de différenciation, entre les cellules ACM et HC. Comme le montre les images représentatives, ACM C-MSC s’accumule des gouttelettes de lipides plus que HC C-MSC après 72 h de culture dans un milieu adipocytaire (Figure 3). Ces différences sont également maintenues lorsque les cellules sont exposées à des conditions de la différenciation adipocytaire pendant une longue période (1 semaine) (Figure 3). Vidéo 1 : Intégration de la carte electroanatomical et échocardiographie intracardiaque. Electroanatomical unipolaire endocardique mappe du ventricule droit (vues gauche antérieurs obliques et droit antérieurs obliques) chez un patient ayant subit une biopsie endomyocardique (panneaux inférieurs). Des zones limitées de la basse tension (rouge/vert) sont visibles à l’apex. Endomyocardique bioptique (marqué comme cercle) sont prélevés dans la correspondance pour le myocarde malade et le septum interventriculaire. Échocardiographie intracardiaque en temps réel permet de vérifier la position correcte de la bioptome à la zone de la cible (du haut). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Vidéo 2 : vidéo de la fluoroscopie en vue oblique antérieure droite. Le bioptome est insérée dans une gaine longue orientables et avancé dans le ventricule. Après une vérification minutieuse du contact bioptome avec le myocarde, les mâchoires sont ouvertes et ensuite solidement fermées pour prélever l’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Figure 1: projet de procédure. L’échantillon de bioptic endomyocardique est recueillie à l’aide d’un cathéter de bioptome, un instrument de petite coupe en forme de pince. Le poids de la biopsie obtenue est d’environ 5 mg (A). L’échantillon de bioptic endomyocardique est haché dans 0,5 – fragments de 1 mm de3 , avec des ciseaux stériles (B), et solution de collagènase est ajoutée. L’échantillon est placé dans un incubateur à 37 ° C sur un mélangeur rotatif de plate-forme pour 1,5 h de digestion (C). La solution digérée est centrifugée et plaquée dans les eut dans un plat en plastique (D). C-MSC sont obtenus grâce à leurs propriétés d’adhérence en plastique soit dans des cellules individuelles ou des clones ou jaillissant de petits fragments non digérés de bioptique (E). C-MSC sont ensuite caractérisés par cytométrie en flux (F). C-MSC sont plaqués dans un milieu adipocytaire et accumulation de gouttelettes de lipides est testée par Oil Red O coloration (G). Barres d’échelle indiquent 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2: représentant cyto-fluorimétrique Voir le profil :: C-MSC. Chaque histogramme montre le nombre d’éléments par rapport à l’intensité de fluorescence dans le chenal indiqué (PE : phycoérythrine ; APC : allophycocyanin ; FITC : fluorescéine-isothyocyanate). Dans chaque graphique, le contrôle de l’isotype (blanc) et un échantillon conjugués avec la cellule spécifique anticorps de marqueur de surface (rouge) sont affichées. C-MSC sont positifs pour les mésenchymateuses antigènes de surface CD29, CD44, CD105 et, partiellement, CD90, considérant qu’ils n’expriment pas CD31, CD34, CD14, CD45 et HLA-Dr. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3: différenciation adipocytaire de C-MSC. Des images représentatives de l’ACM et HC C-MSC, cultivées dans un milieu adipocytaire pendant 72 h et 1 semaine, tachée de ORO (photos de gauche ; n = 3). Dans les graphiques droite, quantification de la luminance de la coloration rouge-255 canaux est rapportée : intensité est exprimée en unités arbitraires (U.A.). ACM C-MSC s’accumulent des gouttelettes de lipides plus que chez les témoins. Test T de Student a été utilisé, * : p < 0,05. Barres d’échelle indiquent 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

MSC et C-MSC : CSM sont des cellules multipotentes résidents dans la fraction stromale de différents tissus adultes, tels que la moelle osseuse, tissu adipeux, cartilage, cerveau, peau, annexes fœtales et coeur12. Différentes études ont été menées pour isoler et caractériser des applications potentielles dans la recherche fondamentale et translationnelle12,13.

Dans des conditions saines, MSC sont quiescentes, autorenouvellement à taux bas14. Car ils sont exposés à des changements pathologiques environnementaux, ils réagissent transformant des tissus favorisant par directe transdifférenciation, dépôts de matrice ou par effet paracrine14.

Le SMC cardiaque (C-SMC) représentent une population de cellules grand non-myocyte cardiaque4. Ils proviennent de l’épicarde et migrent dans le myocarde engagée dans le processus de transition épithéliale-mésenchymateuse15. Ils contribuent à l’intégrité mécanique et électrique de la structure cardiaque physiologique tant dans les états pathologiques, grâce à des interactions avec les cardiomyocytes et matrice extracellulaire homéostasie7,16. Toutefois, les fonctions de la large gamme du C-SMC n’est pas encore entièrement comprise. Une connaissance plus approfondie de leur rôle qu’aussi bien dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être facilitées par des études in vitro effectuées après leur isolement.

C-MSC ont été obtenus de différents districts du cœur humain, tels que l’auricule2,17 et le ventricule droit18.

Récemment, C-MSC myocardique ventriculaire droite humaine bioptic échantillons ont été obtenus8, ce qui démontre que le tissu de la source pourrait être aussi peu que 3-5 mg.

Applications possibles : La méthode décrite dans ce manuscrit permet d’obtenir des cellules avec quelques passages simples, telles que la digestion et de sélection pour une adhésion en plastique, d’après des échantillons très petits coeur.

C-MSC peut considérer comme un modèle de cellulaire, car ils sont faciles à amplifier et à maintenir en vitroet sont capables de se différencier en cellules de lignée mésenchymateuse (endothélium, ostéocytes et adipocytes). En outre, la possibilité d’obtenir des cellules directement à partir de patients constitue un outil de grande in vitro pour des études mécanistes dans le contexte de la médecine personnalisée/précision. En effet, ces cellules transportent le bagage génétique et des mutations spécifiques éventuellement des bailleurs de fonds et sont influencées par les caractéristiques des patients spécifiques, tels que les conditions cliniques, l’âge, sexe, style de vie et des médicaments. En outre, la possibilité de classer pour les différents marqueurs peut permettre l’étude de sous-ensembles spécifiques C-MSC19.

C-MSC sont connus pour être des joueurs actifs dans différentes maladies cardiovasculaires, surtout caractérisées par un remodelage défavorable du cœur. Par conséquent, ils représentent des objectifs de candidat pour nouvelles stratégies thérapeutiques lutter contre les maladies cardiaques,8,20.

Propriétés tige C-MSC et leur manque d’immunogénicité significative suggère leur utilisation potentielle dans la thérapie cellulaire pour la médecine régénérative cardiaque. En effet, comme MSC de moelle osseuse ou d’autres sources, C-MSC pourrait potentiellement servir tant en autologue dans paramètres de l’allogreffe, sans la nécessité pour l’appariement entre donneur et receveur21.

En outre, C-MSC, être isolé directement à partir de tissus cardiaques, ont l’avantage d’être préconditionnés par le micro-environnement cardiaque et le profil épigénétique. Dans le cadre de la médecine régénérative cardiaque, cela pourrait être particulièrement important d’obtenir de bons résultats.

Jusqu’à présent, les études précliniques de la médecine régénérative identifié potentiel thérapeutique utile dans le C-SMC et leurs paracrine activité18,22,23. Ce qui est important, des essais cliniques dans lesquels la source de la cellule est le cœur sont en cours avec cellules dérivées de cardiosfere ou sous-populations de C-MSC13,24,25. Toutefois, en ce qui concerne les os-moelle osseuse MSC, différents protocoles peuvent être nécessaires d’obtenir la clinique de grade C-MSC26.

C-MSC en ACM : Le protocole présenté est surtout adapté pour l’étude des pathologies pour lesquelles une biopsie endocardique est indiquée. ACM patients subissent des procédures bioptic pour fins de diagnostic,27. Leur myocarde est progressivement remplacé par le tissu cicatriciel, un tissu électriquement inerte composé d’adipocytes et la fibrose. Afin de guider l’échantillonnage bioptic pour le scar, où le rendement diagnostique est maximal, cartographie endomyocardique est utilisé10,28,29. Les échantillons utilisés dans le présent protocole sont prélevés dans la zone frontalière du myocarde malade.

Sommariva et coll. a récemment défini un rôle pivot de C-MSC dans la pathogenèse de l’ACM8, démontrant que C-MSC sont des joueurs actifs dans ACM coeur l’adipogenèse, puisque préadipocytes dans ces coeurs sont d’origine mésenchymateuse. En outre, C-MSC isolé avec le présent protocole de biopsies de patients ACM a montré plus de propension à accumulation de lipides et l’adipogenèse que chez les témoins. Pour cette raison, ces cellules pourraient être utilisées pour confirmer certains des mécanismes moléculaires de l’ACM, prouvant leur convenance comme un modèle de cellules pour les études mécanistiques9.

Limites et des étapes critiques : Malgré les avantages d’obtenir C-MSC directement à partir de patients (voir le paragraphe « Applications possibles »), le présent protocole est soumis à des limites différentes.

Tout d’abord, la procédure bioptique cardiaque est envahissante et souvent évités si pas strictement nécessaire. En effet, le prélèvement d’échantillons de tissu cardiaque est problématique tant sur le plan éthique et techniquement. Raisons pour effectuer une biopsie cardiaque peuvent être la réalisation d’un diagnostic précis dans le contexte des cardiomyopathies dans diagnostic différentiel, surveiller l’état des transplantations cardiaques, ou s’être assuré de la présence d’une tumeur de coeur30. Par conséquent, seuls les patients pour lesquels une biopsie endomyocardique est indiquée par un consensus Déclaration31 peuvent s’inscrire pour la recherche sur C-MSC. En outre, la procédure bioptique cardiaque peut avoir complications cliniques, surtout dans les coeurs cardiomyopathique. Par conséquent, échantillonnages d’électrophysiologiste sont toujours prudents et échantillons bioptic pourraient être très petits, compromettre l’isolement de cellules. Expériences futures pourraient surmonter ce problème de concentration de collagénase de tuning ou le moment de la digestion.

C-MSC, comme toutes les cellules humaines primaires, montrent une grande variabilité entre les différents sujets à tous les phénotypes. En effet, cellules de différents sujets sont non seulement génétiquement différents, mais aussi soumis au conditionnement environnement variable. Plus précisément, dans cette expérience, une grande variabilité dans la différenciation adipocytaire, la croissance et l’isolement cellulaire est observée.

Les étapes critiques du présent protocole doivent être reconnu. Si l’échantillon bioptic comporte capillaires, ils doivent être supprimés pour éviter l’isolement parallèle des cellules endothéliales, qui peuvent contaminer la culture C-MSC et peut être attesté par l’analyse de FACS (positivité pour CD31). Pour obtenir une différenciation adipocytaire efficace, les cellules doivent être dans une phase de croissance active. Le degré de confluence peut-être également influencer l’accumulation de lipides.

Importance de la méthode : En ce qui concerne les méthodes précédentes d’isolement de cellules stromales mésenchymateuses, c’est la première fois où la description d’obtention C-MSC directement à partir des échantillons humains de bioptic ventriculaires est proposée en détail. Bien que cette méthode est suggérée pour le traitement des échantillons de patients ACM, c’est potentiellement applicable à tous les patients pour lesquels une biopsie cardiaque est indiquée.

Ce protocole représente une implémentation utile des méthodes précédentes pour l’obtention de cellules nécessitant de plus gros échantillons cardiaques32, qui sont souvent difficiles à collecter.

En outre, la source de l’échantillon constitue une innovation intéressante. Alors que la biopsie ventriculaire est généralement effectuée sur le septum33, ce protocole prend en compte les échantillons obtenus à partir de la paroi ventriculaire droite libre. Cellules dérivées du quartier ventriculaire droit des malade peuvent être plus représentatifs de l’état pathologique des maladies impliquant des RV

En outre, certaines des réactifs utilisés dans le présent protocole sont différentes en ce qui concerne les autres C-MSC isolement et différenciation méthodes32. Par exemple, le type de collagénase proposée dans ce manuscrit est un mélange de classe I et classe collagénases II avec un ratio équilibré d’activités protéolytiques. En outre, la solution de digestion est composée de la combinaison de collagénase dissoute dans le même milieu basal (IMDM) utilisé pour la préparation du milieu de culture de C-MSC, permettant aux C-MSC isolé pour s’adapter aux conditions de croissance future.

En outre, bien que les procédures de tri pourrait normaliser le lot de la cellule, à l’aide de l’ensemble de la population C-MSC, isolés seulement par le biais de la propriété de l’adhérence en plastique de ces cellules, constitue une simplification sans altérer l’immunophénotypiques caractéristiques du SMC-C. La composition de T. ADIPO proposées dans ce manuscrit est en mesure de mener à la différenciation adipocytaire, évitant le dérèglement métabolique induit par d’autres composantes telles que l’insuline.

En outre, la méthode proposée de quantification d’accumulation de lipides, qui repose sur l’évaluation de l’intensité colorimétrique de ORO, fournit plus d’informations sur la quantité des lipides accumulés, si on les compare avec les méthodes basées uniquement sur le pourcentage des cellules positives pour la coloration de ORO. Souvent les accumulation de lipides est quantifiée en extrayant l’ORO constituée par les cellules avec l’isopropanol et mesurer l’absorbance. Toutefois, cette méthode nécessite plusieurs passages et est soumise à la variabilité due à l’évaporation de l’alcool isopropylique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le ministère italien de la santé, Ricerca Corrente au Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materials

IMDM Gibco by Life Technologies  12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
PENICILLIN STREPTOMYCIN Life Technologies Italia 15140122
Collagenase NB4 Serva 17454.02
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B
L-glutammine Sigma-Aldrich G7513
PBS Lonza 17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) Gibco 12563029
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Trypsin-EDTA solution  Sigma-Aldrich T6689
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS D.b.a. Italia S.r.l. sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855
Antibody CD14-FITC (MφP9) Becton Dickinson 345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) Becton Dickinson 561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11) R&D Systems FAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) Thermo Fisher Scientific  CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26) Becton Dickinson 561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) Thermo Fisher Scientific MHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) Becton Dickinson 561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) Becton Dickinson 562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizer Gima  35642
Bench centrifuge Sigma 3-16K Sigma Centrifuges 10330
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific  5100-0001
AxioVert 200M microscope  Zeiss B 40-080 e 03/01
FACS Gallios Beckman Coulter  773231AF
ImageJ (image processing program) NIH
Stericup filter units Merck S.P.A.  SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mL Eppendorf 30122178
Conical Tubes, 15 mL Eppendorf 30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430167
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430166
6 well TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Falcon 352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk Sigma-Aldrich BR719520
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Pilato, C. A., Stadiotti, I., Maione, A. S., Saverio, V., Catto, V., Tundo, F., Dello Russo, A., Tondo, C., Pompilio, G., Casella, M., Sommariva, E. Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients. J. Vis. Exp. (132), e57263, doi:10.3791/57263 (2018).
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