Isolatie en karakterisatie van cardiale mesenchymale stromale cellen uit de Bioptic monsters Endomyocardial van Arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten

Deze aanpak in overeenstemming is met de verklaring van Helsinki en rechts ventriculaire monsters was (07/06/2012) door “Centro Cardiologico Monzino IRCCS” ethische commissie goedgekeurd. 1. oplossingen Maken van TMES medium voor C-MSC cultuur met Iscove van bewerkt Dulbecco Medium (IMDM), aangevuld met 20% foetale boviene Serum (FBS), 10 ng/mL basis fibroblast groeifactor, 10.000 U/mL penicilline, 10.000 µg Mo/mL streptomycine en 0,02 M L-Glutamine. Filteren van het TMES medium met behulp van een 0,22 µm steriele filter eenheid en bewaren bij 4 ° C. Ter voorbereiding van collagenase oplossing, resuspendeer de collagenase NB4 mix op IMDM middellange tot het verkrijgen van een definitieve oplossing met een concentratie van 3 mg/mL. Vortex zachtjes te ontbinden van het poeder en filtreer de oplossing van de collagenase met behulp van een filter van 0,2 µm spuit. Aliquot 1 mL volume in 2 mL steriele buizen en opslag bij-20 ° C tot die nodig zijn voor gebruik. Bereiden van T. ADIPO medium te maken adipogenic medium met IMDM medium aangevuld met 10% FBS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (vooraf verdund in dimethylsulfoxide (DMSO) met een concentratie van 0,5 M en bewaard bij-20 ° C tot gebruik), 1 µM hydrocortison (vooraf verdund in DMSO op 100 mM en verder verdund tot 10 mM in steriel gedistilleerd water en bewaard bij-20 ° C tot gebruik) en 0.1 mM indomethacin (vooraf verdund in DMSO bij een concentratie van 0,5 M en bewaard bij-20 ° C tot gebruik). Filteren van het T. ADIPO-medium met behulp van een 0,22 µm steriele filter eenheid en bewaren bij 4 ° C. Bereiden van wassen buffer samengesteld uit fosfaat gebufferde zoutoplossing 0.0067 M PO4 (PBS), ethyleendiamine tetra azijnzuur (EDTA) 5 mM, en 5% bovien serumalbumine en bewaren bij 4 ° C. Bereiden olie rood O (ORO) werkende oplossing door ontbinding van 1% ORO poeder in 60% isopropanol, mengen voor 2 h en filteren met behulp van een 0,22 µm filter eenheid precipitaten verwijderen. Bewaar de werkoplossing bij kamertemperatuur (RT). 2. isolatie van cardiale mesenchymale stromale cellen Cardiale biopsie verzameling en verwerkingOpmerking: voordat u begint, zorg ervoor dat de collagenase oplossing en het TMES medium klaar. Zet de ACM endomyocardial biopsie (meestal ongeveer 5 mg van weefsel) in een steriele buis gevuld met TMES en het vervoer naar het laboratorium.Opmerking: ACM biopten worden verzameld in de operatiekamer electrofysiologie volgens eerdere rapporten10. Kortom, de integratie van electro-anatomische mapping en intracardiac echocardiografie in het rechterventrikel (Zie Video 1) wordt gebruikt om te sturen van de biopsie endomyocardial (Zie Video 2, fluoroscopie) schriftelijk aan de rand-zone van de zieke myocard. Gezonde controle (HC) monsters worden geleverd door een bio-weefselbank, verkregen uit de rechts-ventriculaire gratis muur van dode foetussen donoren binnen de 24 uur van de dood (overlijden door een ongeval, gezonde proefpersonen). Tijdens het vervoer en vóór dissectie, slaan de biopsie in TMES bij 4 ° C. De tijd tussen biopsie verzameling en verwerking van het weefsel (max 24 h) te beperken. Instellen van de biologische veiligheid kabinet met vereiste oplossingen voor het uitvoeren van de procedure tot de enzymatische spijsvertering. Zet de sterilisator onder de motorkap en zet het instrument 15 min vóór gebruik totdat de temperatuur 200-250 ° C. stijgt Steriliseren schaar en pincet voor 10 s. Make zeker de gesteriliseerde instrumenten zijn koud vóór gebruik. Wegwerp steriele scalpels voor te bereiden. Plaats de buizen met de biopsie in de steriele kap. Open de tube en breng de biopsie in een steriele plaat. Wassen van de biopsie rechterventrikel tweemaal met 3 mL steriele PBS. Als u nemen van een foto van de biopsie op de Microscoop wilt. Overdracht van het rechterventrikel biopsie, met behulp van steriele pincet, in een steriele 2 mL-buis met 1 mL van de oplossing van collagenase. Het monster in 0.5 – 1 mm3 stukjes gesneden met een steriele schaar. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C onder continu roterende agitatie. Centrifugeer het verteerd oplossing bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL steriele PBS te wassen de pellet. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMES voedingsbodem. Plaat van de verkregen schorsing op steriele 60 mm Weefselkweek behandeld bord en TMES medium tot het eindvolume van 3 mL toevoegen. Incubeer de plaat in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2.Opmerking: Een hoger volume van medium kan voorkomen dat de juiste hechting van een verteerd biopsie fragmenten. Gooi na 24 h, het medium om niet-aanhanger cellen en puin te verwijderen.Opmerking: Afzonderlijke gedissocieerde mesenchymale cellen kunnen hechten aan het plastic oppervlak en aanleiding geven tot klonen; ook kunnen onverteerd kleine biopsie fragmenten hechten aan de kunststof schotel en laat cel kiemen. Wassen van de plaat twee keer met 5 mL steriele PBS en voeg 3 mL verse TMES medium. Vervang het TMES medium drie keer per week tot de cellen 80% heuvels zijn.Opmerking: Het aantal gekoppelde cellen hangt af van de kwaliteit, de hoeveelheid weefsel, en de efficiëntie van de spijsvertering. 3. cel expansie Opmerking: Zorg ervoor dat heb TMES medium klaar voordat u begint. Wanneer de cellen 80% confluente, overdracht de verteerd kleine bioptic monsters in een nieuwe steriele 60 mm Weefselkweek behandeld plaat en voeg 3 mL verse TMES medium.Opmerking: De bioptic monsters kunnen worden hergebruikt voor verdere C-MSC isolatie. Het is mogelijk deze procedure herhalen totdat er een aanzienlijk aantal geïsoleerde cellen. De gekoppelde cellen tweemaal met 3 mL steriele PBS te wassen. Voeg trypsine-EDTA-oplossing (0,5 mL voor een schotel van 60-mm) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten om mobiele-detachement. Wanneer de cellen worden losgemaakt van het oppervlak van de plaat, Voeg 0,5 mL steriele FBS inactivering van de trypsine en verzamelen van cellen in een nieuwe steriele tube van 50 mL. Wassen van de plaat twee keer met 5 mL steriele PBS de resterende cellen toevoegen aan de dezelfde buis. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMES voedingsbodem. Laden 10 µL van de celsuspensie in de cel tellen kamer.Opmerking: Als de cellen ook geconcentreerd, Verdun de eerste schorsing 1:10 in PBS en laden van 10 µL van de verdunde cellen in de cel tellen kamer. Onder de Microscoop, cellen in 3 grote pleinen en op de regels van twee van hun kant tellen en het gemiddelde aantal cellen berekenen.Opmerking: Voor het verkrijgen van het aantal cellen/mL, het gemiddelde van de getelde cellen wordt vermenigvuldigd met 104, de verdunningsfactor van de cel tellen kamer. Als de cellen hebben zijn verder verdund, vermenigvuldigen voor de verdunningsfactor. De verhouding tussen het aantal cellen om het zaad en de concentratie van de cel (aantal cellen/mL) komt overeen met het volume (in mL) van de eerste schorsing te worden vergulde voor de volgende stap (punt 3.9). Plaat van de resuspensie op steriel 100 mm Weefselkweek behandeld platen op een eindconcentratie van 5.000-10.000 cellen/cm2 en TMES medium tot het eindvolume van 8 mL toevoegen. Incubeer de plaat in een cel cultuur incubator.Opmerking: Herhaal de cel expansie procedure wanneer de cellen 70-80% heuvels zijn. Bij elke passage (P), is het aanbevolen om het cryopreserve deel van de cellen en de plaat het resterende bedrag. De cellen uit te breiden tot P3 of P4 en gebruik voor TL-activated cell sorter (FACS) analyse (punt 4) en adipogenic differentiatie (sectie 5). Centrifugeer voor cryopreservatie na detachement, de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT. Cellen tellen als beschreven (stappen 3.7-3,8) en 1 x 106 cellen in 900 µL van steriele FBS resuspendeer. Een steriele cryo-flacon overbrengen en voeg 100 µL van steriele DMSO en mix. Snel opslaan de cryo-flesjes bevriezing verpakkingsgasssen bij-80 ° C gedurende ten minste 2 dagen en breng vervolgens de flesjes in vloeibare stikstof. 4. karakterisering van cardiale mesenchymale stromale cellen door Stroom Cytometry Opmerking: Voordat u begint, zorg ervoor dat de cel dissociatie reagens, wasmachine buffer en de specifieke antilichamen bereid hebben. Wanneer het celaantal bereikt minstens 3 x 10 wassen6 (graaf de cellen als in 3.7-3.8 beschreven), de 100-mm plaat tweemaal met 10 mL steriele PBS. Voeg 5 mL van een cel dissociatie reagens en 7-10 min op RT dat de mobiele-detachement wachten. Wanneer de cellen worden losgemaakt van het oppervlak van de plaat, voeg toe 15 mL steriele wassen buffer en de schorsing te verzamelen in een nieuwe steriele tube van 50 mL. Wassen van de plaat twee keer met 10 mL buffer te wassen en voeg de resterende cellen aan de dezelfde buis. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten bij RT en resuspendeer de pellet in 1 mL buffer te wassen. Cellen tellen als beschreven (stappen 3.7-3.8), en 3 x 106 cellen overboeken naar een nieuwe steriele buis en wassen buffer aan het uiteindelijke volume van 1,5 mL toevoegen.Opmerking: De cel Totaal aantal en het totale volume van wassen buffer is afhankelijk van het aantal geselecteerde markeringen gebruikt bij de analyse (3 x 10-5 cellen in 100 µL voor elke FACS polystyreen buis). Verdelen van 100 µL van cellulaire suspensie in 12 verschillende FACS polystyreen buizen, en voeg het specifieke antilichaam aan de concentratie in het gegevensblad product aangegeven.Opmerking: Antilichamen gebruikt voor de karakterisering van het C-MSC zijn CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 en HLA-DR (tabel 1). Het is belangrijk om te bereiden een controlemonster samengesteld uit 100 µL van de geresuspendeerde cellen gekleurd met de isotype te controleren om te controleren de specificiteit van het signaal. Incubeer de monsters gedurende 15 min. in het donker. Voeg 1 mL steriele wassen buffer aan elke buis om te stoppen met de reactie. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 minuten op RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 µL van het wassen van de buffer. Ga verder met de karakterisering van het C-MSC met stroom cytometry. 5. Adipogenic differentiatie van cardiale mesenchymale stromale cellen Opmerking: Voordat u begint, zorg ervoor dat T. ADIPO medium en ORO werkoplossing hebt voorbereid. Cultuur in T. ADIPO medium Loskoppelen en de cellen zoals beschreven in sectie 3 tellen. Plaat 3 x 105 cellen op elk putje van een steriele 6-well Weefselkweek behandeld plaat in 2 mL zuiver T. ADIPO medium. Laat C-MSC onderscheiden in T. ADIPO medium voor 72 uur of 1 week, veranderen van gemiddeld elke 2-3 dagen. Olie Red O kleuringOpmerking: gebruik olie Red O (ORO) vlekken om te testen de lipide-accumulatie in C-MSC. Plaats de 6-well weefselkweek plateunder de zuurkast. Verwijder het medium van de adipogenic en wassen van de cellen tweemaal met 2 mL PBS. Toevoegen van de voldoende hoeveelheid 4% paraformaldehyde (PFA) ter dekking van elk goed. Bevestigen van de cellen gedurende 5 minuten op RT. PFA negeren en wassen van de cellen tweemaal met 2 mL PBS. Incubeer de vaste cellen met ORO werkende oplossing voor 1 h op RT, met behulp van genoeg volume ter dekking van elk goed.Opmerking: Houd niet de 6-well weefselkweek plaat onder de zuurkast tijdens ORO incubatie om te voorkomen dat de verdamping van de ORO werkoplossing. Verwijder alle ORO werkoplossing en wassen met 2 mL PBS 3 – 5 keer totdat de plaat is volledig gereinigd; Gooi wast. Stop de wasbeurten wanneer de PBS gebruikt duidelijk is en als je niet ziet, onder de Microscoop, aspecifieke kleuring uit de cellen. 20 opnamen bij 20 X vergroting voor elk putje met behulp van de omgekeerde weefselkweek fase contrast Microscoop. De foto’s worden geopend met het programma van de verwerking van het beeld te kwantificeren van de cel ORO accumulatie. Scheid de verschillende kleurkanalen via de functie “Kanalen splitsen” om te kwantificeren van alleen de helderheid in het kanaal van 255-rood. Het aantal cellen voor elke afbeelding door het tellen van de kernen. Normaliseren de ORO signaal intensiteit op het nummer van de cel. Bereken het gemiddelde van de resultaten voor elke afbeelding van hetzelfde monster.