Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)
Summary
Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bu protokolün amacı, duvar hücreleri tarafından yönlendirilen nöbetler sırasında kılcal kan akışı etkilerini aydınlatmak için spesifik uygulamasında fiber-optik-demet bağlantılı klinik öncesi konfokal lazer taramalı endomikroskopiyi (pCLE) tanımlamaktır. İn vitro ve in vivo kortikal görüntüleme, perisitler tarafından yönlendirilen kılcal daralmaların, sağlıklı hayvanlarda fonksiyonel lokal nöral aktivitenin yanı sıra ilaç uygulamasından da kaynaklanabileceğini göstermiştir. Burada, epilepside nöral dejenerasyonda mikrovasküler dinamiklerin rolünü belirlemek için pCLE’nin nasıl kullanılacağına dair bir protokol sunulmaktadır, herhangi bir doku derinliğinde (özellikle hipokampusta). Anesteziklerin nöral aktivite üzerindeki potansiyel yan etkilerini ele almak için uyanık hayvanlarda pCLE kaydetmek için uyarlanmış bir baş desteği tekniğini tanımladık. Bu yöntemler kullanılarak, beynin derin sinir yapılarında birkaç saat boyunca elektrofizyolojik ve görüntüleme kayıtları yapılabilir.
Introduction
Diğer mikroskobik görüntüleme yöntemlerinin 1,2,3,4,5,6,7,8 aksine, in vivo fiber optik tabanlı konfokal mikroskopi, herhangi bir beyin bölgesinde, herhangi bir derinlikte, yüksek hızda (görüş alanı boyutuna bağlı olarak 240 Hz’e kadar) kan akış dinamiklerinin ölçülmesine olanak tanır 9 ). Bir fiber optik prob, 3 μm çözünürlükte in vivo konfokal lazer tarama görüntülemeye olanak tanır, çünkü probun ucu (5000-6000 3 μm çapında ayrı liflerden oluşan bir demetten oluşan lenssiz bir objektif) bir mikroelektrot doğruluğu ile ilgilenilen floresan hedefinin 15 μm içinde konumlandırılabilir. İn vivo iki fotonlu görüntülemede olduğu gibi, floroforlar görüntüleme hedefine önceden dahil edilmelidir. Örneğin, floresein dekstran (veya kuantum noktaları) vaskülatüre enjekte edilebilir veya genetik olarak kodlanmış floresan proteinler hücrelere transfekte edilebilir veya Oregon Green BAPTA-1 gibi floresan boyalar, görüntülemeden önce hücrelere toplu olarak yüklenebilir.
Bu teknikleri kullanan son araştırmalar, iktal kılcal vazospazmlara yol açan duvar hücresi motor aktivitesinin – nöbetlersırasında duvar hücrelerinin pozisyonunda meydana gelen ani daralmalar 9 – iktal hipokampusta nörodejenerasyona katkıda bulunabileceğini bulmuştur9. Önceki görüntüleme çalışmaları ilaç uygulamalarına bağlı in vitro ve in vivo perisit daralmalarıgösterirken 6,7,10,11,12, Leal-Campanario ve ark. murin beyninde in vivo spontan kılcal daralmaların ilk kanıtını buldu. İnsan temporal lob epilepsisi ile alaka kurmak için, insan epizodik ataksisi tip 1 15’in genetik bir modeli olan erkek (P30-40 eski) nakavt (KO) Kv1.1 (kcna1-null) fareler14,15 (JAX stok #003532) üzerinde çalıştılar. Perisitler, spontan epileptik hayvanlarda ve onların vahşi tip (WT) yavrularında hem patolojik hem de fizyolojik hipokampal duvar vazokonstriksiyonlarını9 tetikledi. Bu gözlemler, kainik asit ile epileptik hale getirilen WT hayvanlarında tekrarlandı ve böylece diğer epilepsi formlarına genellendiklerini gösterdi. Leal-Campanario ve arkadaşları ayrıca, yeni stereolojik mikroskopi yaklaşımları kullanarak, epileptik hayvanlardaki apoptotik (ancak sağlıklı olmayan) nöronların hipokampal mikrovaskülatüre uzamsal olarak bağlandığını belirlediler. Eksitotoksisitenin vaskülatür ile bilinen bir uzamsal ilişkisi olmadığından, bu sonuç anormal kapiller vazospazmik iskemiye bağlı hipoksinin epilepside nörodejenerasyona katkıda bulunduğunu göstermiştir. Şekil 1, genel kurulumun bir şemasını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uyanık farelerde eşzamanlı elektrofizyolojik ve fiber optik pCLE deneyleri için bir baş başlığı kısıtlama sistemi geliştirdik ve anestezik ilaçlara bağlı potansiyel yanıt kontaminasyonunu azalttık. Başlık ve montaj aparatının yapımı kolaydır ve kronik uyanık davranan görüntüleme deneyleri için yeniden kullanılabilir. Kayıtların kalitesini, in vivo mikroskobik kan akışı görüntüleme için altın standart olan TPLSM’ye göre kontrol ettik.
Burada tanımladı?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje, Amerikan Epilepsi Derneği’nden bir Araştırma Girişimi Ödülü ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu’ndan SLM’ye bir ödülün yanı sıra Körlüğü Önleme Araştırmaları A.Ş.’den SUNY Downstate Sağlık Bilimleri Üniversitesi Oftalmoloji Bölümü’ne, New York Eyaleti İmparatorluğu İnovasyon Programı’na bir meydan okuma hibesi ile finanse edildi. ve Ulusal Bilim Vakfı (0726113, 0852636, & 1523614), Barrow Nöroloji Vakfı, Bayan Marian Rochelle, Bayan Grace Welton ve Dignity Health SEED ödüllerinden ve Ulusal Bilim Vakfı’ndan (0726113, 0852636, & 1523614) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü’nden (Ödüller R01EY031971 VE R01CA258021), SLM ve SMC’ye federal hibeler. Bu çalışma aynı zamanda Sağlık İşlerinden Sorumlu Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi tarafından da desteklenmiştir. W81XWH-15-1-0138, SLM’ye L.-C., İspanya Eğitim Bakanlığı’ndan José Castillejo bursu ile desteklendi. Teknik tavsiyeleri ve yardımları için O. Caballero ve M. Ledo’ya teşekkür ederiz.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
