Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a fibras (pCLE) in vivo de capilares del hipocampo en ratones despiertos
Summary
Mientras que las imágenes multifotónicas solo son efectivas a profundidades limitadas de la superficie del tejido, es posible lograr imágenes con una resolución de 3 μm a cualquier profundidad a través de pCLE. Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de pCLE para medir la dinámica microvascular en el hipocampo de ratones ictales y salvajes.
Abstract
El objetivo de este protocolo es describir la endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a haces de fibra óptica (pCLE) en su aplicación específica para dilucidar los efectos del flujo sanguíneo capilar durante las convulsiones, impulsados por las células murales. Las imágenes corticales in vitro e in vivo han demostrado que las constricciones capilares impulsadas por los pericitos pueden ser el resultado de la actividad neuronal local funcional, así como de la aplicación de fármacos, en animales sanos. Aquí, se presenta un protocolo sobre cómo usar pCLE para determinar el papel de la dinámica microvascular en la degeneración neural en la epilepsia, a cualquier profundidad de tejido (específicamente en el hipocampo). Describimos una técnica de reposacabezas que ha sido adaptada para registrar la LECp en animales despiertos, para abordar los posibles efectos secundarios de los anestésicos sobre la actividad neuronal. Con estos métodos, se pueden realizar registros electrofisiológicos y de imágenes durante varias horas en estructuras neuronales profundas del cerebro.
Introduction
A diferencia de otros métodos de imagen microscópica 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopía confocal in vivo basada en fibra óptica permite medir la dinámica del flujo sanguíneo en cualquier región del cerebro, a cualquier profundidad, a alta velocidad (hasta 240 Hz dependiendo del tamaño del campo de visión9). Una sonda de fibra óptica permite la obtención de imágenes de escaneo láser confocal in vivo con una resolución de 3 μm porque la punta de la sonda (un objetivo sin lente compuesto por un haz de 5000-6000 fibras individuales de 3 μm de diámetro) se puede colocar con la precisión de un microelectrodo, dentro de los 15 μm del objetivo fluorescente de interés. Al igual que en la obtención de imágenes in vivo de dos fotones, los fluoróforos deben introducirse previamente en el objetivo de la imagen. Por ejemplo, la fluoresceína dextrano (o puntos cuánticos) se puede inyectar en la vasculatura, o las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente se pueden transfectar en las células, o los tintes fluorescentes como Oregon Green BAPTA-1 se pueden cargar a granel en las células, antes de la obtención de imágenes.
Investigaciones recientes que utilizan estas técnicas han encontrado que la actividad motora de las células murales que conduce a vasoespasmos capilares ictales (constricciones repentinas que ocurren en la posición de las células muralesdurante las convulsiones) puede contribuir a la neurodegeneración en el hipocampo ictal9. Mientras que estudios de imagen previos mostraron constricciones pericitarias in vitro e in vivo relacionadas con aplicaciones de fármacos 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. encontraron la primera evidencia de constricciones capilares espontáneas in vivo en el cerebro murino. Para establecer su relevancia para la epilepsia del lóbulo temporal humano, estudiaron ratones machos (P30-40 viejos) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null)14,15 (JAX stock #003532), un modelo genético de ataxia episódica humana tipo 1 15. Los pericitos provocaron vasoconstricciones murales del hipocampopatológicas y fisiológicas 9 en los animales epilépticos espontáneos y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT). Estas observaciones se replicaron en animales WT que se volvieron epilépticos con ácido kaínico, lo que indica su generalización a otras formas de epilepsia. Además, Leal-Campanario et al determinaron, utilizando nuevos enfoques de microscopía estereológica, que las neuronas apoptóticas, pero no sanas, en animales epilépticos estaban acopladas espacialmente a la microvasculatura del hipocampo. Debido a que la excitotoxicidad no tiene una asociación espacial conocida con la vasculatura, este resultado indicó que la hipoxia anormal inducida por isquemia vasoespasmica capilar contribuye a la neurodegeneración en la epilepsia. La Figura 1 muestra un esquema de la configuración general.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un sistema de sujeción de la cabeza para experimentos electrofisiológicos simultáneos y de fibra óptica con pCLE en ratones despiertos, reduciendo la contaminación potencial de la respuesta debido a los fármacos anestésicos. La tapa de la cabeza y el aparato de montaje son fáciles de construir y son reutilizables para experimentos de imágenes de comportamiento despierto crónico. Comprobamos la calidad de los registros con el estándar de oro para la obtención de imágenes microscópicas de flujo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue financiado por un Premio a la Iniciativa de Investigación de la Sociedad Americana de Epilepsia, y un premio de la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona a S.L.M., así como una subvención de desafío de Research to Prevent Blindness Inc. al Departamento de Oftalmología de la Universidad de Ciencias de la Salud SUNY Downstate, el Programa de Innovación Empire del Estado de Nueva York, y otras subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias (0726113, 0852636 y 1523614), la Fundación Neurológica Barrow, la Sra. Marian Rochelle, la Sra. Grace Welton y los premios Dignity Health SEED, y por subvenciones federales de la Fundación Nacional de Ciencias (0726113, 0852636 y 1523614) y del Instituto Nacional de Salud (Premios R01EY031971 Y R01CA258021), a S.L.M y S.M.C. Este trabajo también contó con el apoyo de la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud en virtud del Laudo No. W81XWH-15-1-0138, a S.L.M.. L.-C. contó con el apoyo de una beca José Castillejo del Ministerio de Educación español. Agradecemos a O. Caballero y M. Ledo por su asesoramiento y asistencia técnica.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
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