Summary

Endoscopia pré-clínica de varredura a laser confocal acoplada a fibra in vivo (pCLE) de capilares do hipocampo em camundongos acordados

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Considerando que a imagem multifóton só é eficaz em profundidades limitadas da superfície do tecido, é possível obter imagens com resolução de 3 μm em qualquer profundidade via pCLE. Aqui, apresentamos um protocolo para conduzir imagens de pCLE para medir a dinâmica microvascular no hipocampo de camundongos ictais e selvagens.

Abstract

O objetivo deste protocolo é descrever a endomicroscopia pré-clínica confocal de varredura a laser (pCLE) acoplada a feixe ótico de fibra óptica em sua aplicação específica para elucidar os efeitos do fluxo sanguíneo capilar durante convulsões, impulsionados por células murais. Imagens corticais in vitro e in vivo mostraram que constrições capilares impulsionadas por pericitos podem resultar de atividade neural local funcional, bem como da aplicação de fármacos, em animais saudáveis. Aqui, um protocolo é apresentado sobre como usar o pCLE para determinar o papel da dinâmica microvascular na degeneração neural na epilepsia, em qualquer profundidade tecidual (especificamente no hipocampo). Descrevemos uma técnica de apoio cefálico que foi adaptada para registrar a pCLE em animais acordados, para abordar os potenciais efeitos colaterais dos anestésicos sobre a atividade neural. Usando esses métodos, registros eletrofisiológicos e de imagem podem ser realizados ao longo de várias horas em estruturas neurais profundas do cérebro.

Introduction

Em contraste com outros métodos microscópicos de imagem 1,2,3,4,5,6,7,8, a microscopia confocal baseada em fibra óptica in vivo permite a medição da dinâmica do fluxo sanguíneo em qualquer região cerebral, em qualquer profundidade, em alta velocidade (até 240 Hz, dependendo do tamanho do campo devisão9). Uma sonda de fibra óptica permite imagens confocais de varredura a laser in vivo com resolução de 3 μm porque a ponta da sonda (uma objetiva sem lente composta por um feixe de 5000-6000 fibras individuais de 3 μm de diâmetro) pode ser posicionada com a precisão de um microeletrodo, dentro de 15 μm do alvo fluorescente de interesse. Assim como na imagem in vivo de dois fótons, os fluoróforos devem ser previamente introduzidos no alvo da imagem. Por exemplo, a fluoresceína dextran (ou pontos quânticos) pode ser injetada na vasculatura, ou proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, podem ser transfectadas em células, ou corantes fluorescentes como Oregon Green BAPTA-1 podem ser carregados em massa nas células, antes da imagem.

Pesquisas recentes utilizando essas técnicas descobriram que a atividade motora das células murais levando a vasoespasmos capilares ictais – constrições súbitas que ocorrem na posição das células murais durante convulsões 9 – pode contribuir para a neurodegeneração no hipocampo ictal9. Enquanto estudos de imagem anteriores mostraram constrições pericitárias in vitro e in vivo relacionadas à aplicação de fármacos 6,7,10,11,12, Leal-Campanario e col. encontraram as primeiras evidências de constrições capilares espontâneas in vivo no encéfalo murino. Para estabelecer relevância para a epilepsia do lobo temporal humano, eles estudaram camundongos machos (P30-40 velhos) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), um modelo genético de ataxia episódica humana tipo 115. Os pericitos conduziram vasoconstrições murais hipocampais patológicas e fisiológicas9 nos animais espontaneamente epilépticos e suas ninhadas selvagens (WT). Essas observações foram replicadas em animais WT tornados epilépticos com ácido caínico, indicando assim sua generalização para outras formas de epilepsia. Além disso, Leal-Campanario et al determinaram, usando novas abordagens de microscopia estereológica, que neurônios apoptóticos – mas não saudáveis – em animais epilépticos estavam espacialmente acoplados à microvasculatura hipocampal. Como a excitotoxicidade não tem associação espacial conhecida com a vasculatura, esse resultado indicou que a hipóxia induzida por isquemia vasoespasmódica capilar anormal contribui para a neurodegeneração na epilepsia. A Figura 1 mostra um esquema da configuração geral.

Protocol

O protocolo segue as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Neurológico Barrow. 1. Posicionamento estereotáxico para craniotomia Pesar e anestesiar o rato com um cocktail de ketamina-xilazina (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado, observando sua ausência de reação ao beliscão da cauda e/ou dos …

Representative Results

Desenvolvemos esses métodos para avaliar se vasoespasmos capilares anormais conduzidos por pericitos no hipocampo – que ocorrem como resultado de convulsões – poderiam causar hipóxia franca que contribui para a morte celular no foco ictal 9,13. O desenvolvimento da touca e sua instalação adequada proporcionaram alta estabilidade nos registros, permitindo o registro simultâneo do EEG e do fluxo sanguíneo profundo no hipocampo…

Discussion

Desenvolvemos um sistema de contenção head-cap para experimentos simultâneos de pCLE eletrofisiológico e de fibra óptica em camundongos acordados, reduzindo a potencial contaminação de resposta devido a drogas anestésicas. A tampa da cabeça e o aparelho de montagem são simples de construir e são reutilizáveis para experimentos de imagem crônicos de comportamento acordado. Verificamos a qualidade dos registros em relação ao padrão-ouro para imagens microscópicas de fluxo sanguíneo in vivo, TPLSM.

<p …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O projeto foi financiado por um Prêmio de Iniciativa de Pesquisa da Sociedade Americana de Epilepsia, e um prêmio da Comissão de Pesquisa Biomédica do Arizona para a S.L.M., bem como uma concessão de desafio da Research to Prevent Blindness Inc. e outras concessões da National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), da Barrow Neurological Foundation, da Sra. Marian Rochelle, da Sra. Grace Welton e dos prêmios Dignity Health SEED, e por subsídios federais da National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) e do National Institute of Health (Awards R01EY031971 E R01CA258021), para S.L.M e S.M.C. Este trabalho também contou com o apoio do Gabinete do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde sob o Prêmio nº. W81XWH-15-1-0138, para S.L.M. L.-C. foi apoiado por uma bolsa José Castillejo do Ministério da Educação espanhol. Agradecemos a O. Caballero e M. Ledo por sua assessoria e assistência técnica. 

Materials

0.7 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-07 For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS from Handpiece solution AEU12C
Bull dog serrifine clump Fine Science Tools 18050-28
CellVizio dual band Mauna Kea Technologies
CellVizio single band Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package Reliance Dental Mfg Co. 602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw MSC industrial direct co. 2834117
Fine Point scissor Fine Science Tools 14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) Invitrogen, USA D7137
Halsey smooth needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved Fine Science Tools 12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting Co. 51704 51670
Methocel 2% Omnivision GmbH PZN: 04682367 Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse CWE Inc. 08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters DSI 270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT Stoelting Co.C13 51704
Sel-Tapping bone screws Fine Science Tools 19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic Stoelting Co 51648
Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 Fine Science Tools 18020-40
Tissue separating microspatula Fine Science Tools 10091-121

References

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Cite This Article
Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice. J. Vis. Exp. (194), e57220, doi:10.3791/57220 (2023).

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