Endoscopia pré-clínica de varredura a laser confocal acoplada a fibra in vivo (pCLE) de capilares do hipocampo em camundongos acordados
Summary
Considerando que a imagem multifóton só é eficaz em profundidades limitadas da superfície do tecido, é possível obter imagens com resolução de 3 μm em qualquer profundidade via pCLE. Aqui, apresentamos um protocolo para conduzir imagens de pCLE para medir a dinâmica microvascular no hipocampo de camundongos ictais e selvagens.
Abstract
O objetivo deste protocolo é descrever a endomicroscopia pré-clínica confocal de varredura a laser (pCLE) acoplada a feixe ótico de fibra óptica em sua aplicação específica para elucidar os efeitos do fluxo sanguíneo capilar durante convulsões, impulsionados por células murais. Imagens corticais in vitro e in vivo mostraram que constrições capilares impulsionadas por pericitos podem resultar de atividade neural local funcional, bem como da aplicação de fármacos, em animais saudáveis. Aqui, um protocolo é apresentado sobre como usar o pCLE para determinar o papel da dinâmica microvascular na degeneração neural na epilepsia, em qualquer profundidade tecidual (especificamente no hipocampo). Descrevemos uma técnica de apoio cefálico que foi adaptada para registrar a pCLE em animais acordados, para abordar os potenciais efeitos colaterais dos anestésicos sobre a atividade neural. Usando esses métodos, registros eletrofisiológicos e de imagem podem ser realizados ao longo de várias horas em estruturas neurais profundas do cérebro.
Introduction
Em contraste com outros métodos microscópicos de imagem 1,2,3,4,5,6,7,8, a microscopia confocal baseada em fibra óptica in vivo permite a medição da dinâmica do fluxo sanguíneo em qualquer região cerebral, em qualquer profundidade, em alta velocidade (até 240 Hz, dependendo do tamanho do campo devisão9). Uma sonda de fibra óptica permite imagens confocais de varredura a laser in vivo com resolução de 3 μm porque a ponta da sonda (uma objetiva sem lente composta por um feixe de 5000-6000 fibras individuais de 3 μm de diâmetro) pode ser posicionada com a precisão de um microeletrodo, dentro de 15 μm do alvo fluorescente de interesse. Assim como na imagem in vivo de dois fótons, os fluoróforos devem ser previamente introduzidos no alvo da imagem. Por exemplo, a fluoresceína dextran (ou pontos quânticos) pode ser injetada na vasculatura, ou proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, podem ser transfectadas em células, ou corantes fluorescentes como Oregon Green BAPTA-1 podem ser carregados em massa nas células, antes da imagem.
Pesquisas recentes utilizando essas técnicas descobriram que a atividade motora das células murais levando a vasoespasmos capilares ictais – constrições súbitas que ocorrem na posição das células murais durante convulsões 9 – pode contribuir para a neurodegeneração no hipocampo ictal9. Enquanto estudos de imagem anteriores mostraram constrições pericitárias in vitro e in vivo relacionadas à aplicação de fármacos 6,7,10,11,12, Leal-Campanario e col. encontraram as primeiras evidências de constrições capilares espontâneas in vivo no encéfalo murino. Para estabelecer relevância para a epilepsia do lobo temporal humano, eles estudaram camundongos machos (P30-40 velhos) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), um modelo genético de ataxia episódica humana tipo 115. Os pericitos conduziram vasoconstrições murais hipocampais patológicas e fisiológicas9 nos animais espontaneamente epilépticos e suas ninhadas selvagens (WT). Essas observações foram replicadas em animais WT tornados epilépticos com ácido caínico, indicando assim sua generalização para outras formas de epilepsia. Além disso, Leal-Campanario et al determinaram, usando novas abordagens de microscopia estereológica, que neurônios apoptóticos – mas não saudáveis – em animais epilépticos estavam espacialmente acoplados à microvasculatura hipocampal. Como a excitotoxicidade não tem associação espacial conhecida com a vasculatura, esse resultado indicou que a hipóxia induzida por isquemia vasoespasmódica capilar anormal contribui para a neurodegeneração na epilepsia. A Figura 1 mostra um esquema da configuração geral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos um sistema de contenção head-cap para experimentos simultâneos de pCLE eletrofisiológico e de fibra óptica em camundongos acordados, reduzindo a potencial contaminação de resposta devido a drogas anestésicas. A tampa da cabeça e o aparelho de montagem são simples de construir e são reutilizáveis para experimentos de imagem crônicos de comportamento acordado. Verificamos a qualidade dos registros em relação ao padrão-ouro para imagens microscópicas de fluxo sanguíneo in vivo, TPLSM.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto foi financiado por um Prêmio de Iniciativa de Pesquisa da Sociedade Americana de Epilepsia, e um prêmio da Comissão de Pesquisa Biomédica do Arizona para a S.L.M., bem como uma concessão de desafio da Research to Prevent Blindness Inc. e outras concessões da National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), da Barrow Neurological Foundation, da Sra. Marian Rochelle, da Sra. Grace Welton e dos prêmios Dignity Health SEED, e por subsídios federais da National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) e do National Institute of Health (Awards R01EY031971 E R01CA258021), para S.L.M e S.M.C. Este trabalho também contou com o apoio do Gabinete do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde sob o Prêmio nº. W81XWH-15-1-0138, para S.L.M. L.-C. foi apoiado por uma bolsa José Castillejo do Ministério da Educação espanhol. Agradecemos a O. Caballero e M. Ledo por sua assessoria e assistência técnica.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
