In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים
Summary
בעוד שדימות מולטיפוטונים יעיל רק בעומקים מוגבלים מפני השטח של הרקמה, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של 3 מיקרומטר בכל עומק באמצעות pCLE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית pCLE למדידת דינמיקה מיקרו-וסקולרית בהיפוקמפוס של עכברי איקטל ועכברי בר.
Abstract
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר אנדומיקרוסקופיה פרה-אופטית-צרורת לייזר פרה-קלינית מצומדת לייזר (pCLE) ביישום הספציפי שלה כדי להבהיר השפעות זרימת דם נימית במהלך התקפים, המונעים על ידי תאי קיר. הדמיות קליפת המוח In vitro ו-in vivo הראו כי התכווצויות נימיות המונעות על ידי פריציטים יכולות לנבוע מפעילות עצבית מקומית תפקודית, כמו גם מיישום תרופות, בבעלי חיים בריאים. כאן, מוצג פרוטוקול כיצד להשתמש ב- pCLE כדי לקבוע את התפקיד של דינמיקה מיקרו-וסקולרית בניוון עצבי באפילפסיה, בכל עומק רקמה (במיוחד בהיפוקמפוס). אנו מתארים טכניקת ריסון ראש שהותאמה לרישום pCLE בבעלי חיים ערים, כדי לטפל בתופעות לוואי אפשריות של חומרי הרדמה על הפעילות העצבית. באמצעות שיטות אלה, רישומים אלקטרופיזיולוגיים והדמיה יכולים להתבצע במשך מספר שעות במבנים עצביים עמוקים של המוח.
Introduction
בניגוד לשיטות הדמיה מיקרוסקופיות אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8, מיקרוסקופ קונפוקלי מבוסס סיבים אופטיים in vivo מאפשר למדוד את דינמיקת זרימת הדם בכל אזור במוח, בכל עומק, במהירות גבוהה (עד 240 הרץ בהתאם לשדה הראייה9). גשושית סיב אופטי מאפשרת צילום סריקת לייזר קונפוקלית in vivo ברזולוציה של 3 מיקרומטר מכיוון שקצה הגשושית (מטרה ללא עדשה המורכבת מצרור של סיבים בודדים בקוטר 5000-6000 3 מיקרומטר) יכול להיות ממוקם בדיוק של מיקרואלקטרודה, בטווח של 15 מיקרומטר מהיעד הפלואורסצנטי המעניין. בדומה לדימות דו-פוטוני in vivo, פלואורופורים חייבים להיות מוכנסים קודם לכן למטרת ההדמיה. לדוגמה, דקסטרן פלואורסצאין (או נקודות קוונטיות) עשוי להיות מוזרק לתוך כלי הדם, או חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית יכולים להיות מזוהמים לתוך תאים, או צבעים פלואורסצנטיים כגון אורגון ירוק BAPTA-1 יכול להיות טעון בתפזורת לתוך תאים, לפני הדמיה.
מחקר שנערך לאחרונה תוך שימוש בטכניקות אלה מצא כי פעילות מוטורית של תאי קיר המובילה לוואזוספזם נימי איקטלי – התכווצויות פתאומיות המתרחשות במיקום תאי הקיר במהלך התקפים 9 – יכולה לתרום לניוון עצבי בהיפוקמפוסהאיקטלי 9. בעוד שמחקרי הדמיה קודמים הראו התכווצויות פריציטים במבחנה ו-in vivo הקשורות ליישומים תרופתיים 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. מצאו את העדות הראשונה להתכווצויות נימים ספונטניות in vivo במוח המוריני. כדי לבסס רלוונטיות לאפילפסיה של האונה הרקתית האנושית, הם חקרו עכברים זכרים (P30-40) נוקאאוט (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), מודל גנטי של אטקסיה אפיזודית אנושית מסוג 115. פריציטים הניעו התכווצויות כלי דם פתולוגיות ופיזיולוגיות בהיפוקמפוס9 בבעלי חיים אפילפטיים ספונטניים ובחבריהם לפסולת מסוג בר (WT). תצפיות אלה שוכפלו בחיות WT שהפכו לאפילפטיות, עם חומצה קאינית, ובכך הצביעו על הכללתן לצורות אחרות של אפילפסיה. בנוסף, Leal-Campanario ועמיתיו קבעו, תוך שימוש בגישות מיקרוסקופיות סטריאולוגיות חדשניות, כי תאי עצב אפופטוטיים – אך לא בריאים – בבעלי חיים אפילפטיים מוצמדים מרחבית למיקרו-כלי הדם של ההיפוקמפוס. מכיוון שלאקסיטוטוקסיות אין קשר מרחבי ידוע לכלי הדם, תוצאה זו הצביעה על כך שהיפוקסיה לא תקינה של נימי וזאספמיה הנגרמת על ידי איסכמיה תורמת לניוון עצבי באפילפסיה. איור 1 מציג סכמה של ההגדרה הכללית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו מערכת ריסון כובע ראש לניסויים אלקטרופיזיולוגיים וסיבים אופטיים בו-זמנית בעכברים ערים, ובכך הפחיתנו זיהום פוטנציאלי בתגובה כתוצאה מתרופות הרדמה. מכסה הראש ומנגנון ההרכבה פשוטים להרכבה וניתנים לשימוש חוזר בניסויי הדמיה כרוניים של התנהגות ערה. בדקנו את איכות הרישומים מול תקן הזהב ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי פרס יוזמת מחקר מהאגודה האמריקאית לאפילפסיה, ופרס מוועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה ל- S.L.M., כמו גם מענק אתגר מ- Research to Prevent Blindness Inc. למחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת SUNY Downstate Health Sciences University, תוכנית החדשנות של האימפריה של מדינת ניו יורק, ומענקים נוספים מהקרן הלאומית למדע (0726113, 0852636 ו-1523614), הקרן הנוירולוגית בארו, גב’ מריאן רושל, גברת גרייס וולטון ופרסי Dignity Health SEED, ומענקים פדרליים מהקרן הלאומית למדע (0726113, 0852636 ו-1523614) ומהמכון הלאומי לבריאות (פרסים R01EY031971 ו-R01CA258021), ל-S.L.M ול-S.M.C. עבודה זו נתמכה גם על ידי משרד עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות תחת פרס מס ‘. W81XWH-15-1-0138, ל- S.L.M. L.-C. נתמך על ידי מלגת חוסה קסטיליחו ממשרד החינוך הספרדי. אנו מודים ל- O. Caballero ול- M. Ledo על עצתם הטכנית ועזרתם.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
