In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen
Summary
Während die Multiphotonen-Bildgebung nur in begrenzten Tiefen von der Gewebeoberfläche aus effektiv ist, ist es möglich, eine Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm in jeder Tiefe über pCLE zu erreichen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von pCLE-Bildgebung zur Messung der mikrovaskulären Dynamik im Hippocampus von iktalen und Wildtyp-Mäusen vor.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) in ihrer spezifischen Anwendung zur Aufklärung von kapillaren Blutflusseffekten während Anfällen, die von Wandzellen angetrieben werden, zu beschreiben. Die kortikale Bildgebung in vitro und in vivo hat gezeigt, dass Kapillarverengungen, die durch Perizyten ausgelöst werden, sowohl durch funktionelle lokale neuronale Aktivität als auch durch die Anwendung von Medikamenten bei gesunden Tieren verursacht werden können. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, wie mit Hilfe von pCLE die Rolle der mikrovaskulären Dynamik bei der neuronalen Degeneration bei Epilepsie in jeder Gewebetiefe (insbesondere im Hippocampus) bestimmt werden kann. Wir beschreiben eine Kopfstützentechnik, die angepasst wurde, um pCLE bei wachen Tieren aufzuzeichnen, um mögliche Nebenwirkungen von Anästhetika auf die neuronale Aktivität zu adressieren. Mit diesen Methoden können elektrophysiologische und bildgebende Aufnahmen über mehrere Stunden in tiefen neuronalen Strukturen des Gehirns durchgeführt werden.
Introduction
Im Gegensatz zu anderen mikroskopischen bildgebenden Verfahren 1,2,3,4,5,6,7,8 ermöglicht die faseroptische konfokale In-vivo-Mikroskopie die Messung der Blutflussdynamik in jeder Hirnregion, in jeder Tiefe, mit hoher Geschwindigkeit (bis zu 240 Hz je nach Sichtfeldgröße9). Eine faseroptische Sonde ermöglicht konfokale In-vivo-Laserscanning-Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm, da die Spitze der Sonde (ein linsenloses Objektiv, das aus einem Bündel von 5000-6000 einzelnen Fasern mit einem Durchmesser von 3 μm besteht) mit der Genauigkeit einer Mikroelektrode innerhalb von 15 μm vom interessierenden Fluoreszenzziel positioniert werden kann. Wie bei der In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung müssen zuvor Fluorophore in das Bildgebungsziel eingebracht werden. Zum Beispiel können Fluorescein-Dextran (oder Quantenpunkte) in das Gefäßsystem injiziert werden, oder genetisch kodierte fluoreszierende Proteine können in Zellen transfiziert werden, oder Fluoreszenzfarbstoffe wie Oregon Green BAPTA-1 können vor der Bildgebung in Zellen geladen werden.
Neuere Forschungen mit diesen Techniken haben ergeben, dass die motorische Aktivität von Wandzellen, die zu iktalen kapillaren Vasospasmen führt – plötzliche Verengungen, die während der Anfälle an der Position der Wandzellen auftreten9 – zur Neurodegeneration im iktalen Hippocampus beitragenkann 9. Während frühere bildgebende Studien in vitro und in vivo Perizytenverengungen im Zusammenhang mit der Anwendung von Medikamentenzeigten 6,7,10,11,12, fanden Leal-Campanario et al. den ersten Hinweis auf in vivo spontane Kapillarverengungen im murinen Gehirn. Um die Relevanz für die menschliche Temporallappenepilepsie zu ermitteln, untersuchten sie männliche (P30-40 alte) Kv1.1 (kcna1-null) Mäuse 14,15 (JAX stock #003532), ein genetisches Modell der menschlichen episodischen Ataxie Typ 115. Perizyten führten sowohl zu pathologischen als auch zu physiologischen Vasokonstriktionen im Hippocampus9 bei den spontan epileptischen Tieren und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern. Diese Beobachtungen wurden in WT-Tieren repliziert, die mit Kainsäure epileptisch gemacht wurden, was auf ihre Generalisierung auf andere Formen der Epilepsie hindeutet. Leal-Campanario et al. stellten außerdem mit Hilfe neuartiger sterelogischer Mikroskopie-Ansätze fest, dass apoptotische, aber nicht gesunde Neuronen bei epileptischen Tieren räumlich an das hippocampale Mikrogefäßsystem gekoppelt waren. Da die Exzitotoxizität keine bekannte räumliche Assoziation mit dem Gefäßsystem hat, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass eine abnorme kapillare vasospasmische Ischämie-induzierte Hypoxie zur Neurodegeneration bei Epilepsie beiträgt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein Kopfkappen-Rückhaltesystem für simultane elektrophysiologische und faseroptische pCLE-Experimente an wachen Mäusen entwickelt, um eine mögliche Kontamination durch Anästhetika zu reduzieren. Die Kopfkappe und die Montagevorrichtung sind einfach zu konstruieren und für chronische Bildgebungsexperimente im Wachzustand wiederverwendbar. Wir überprüften die Qualität der Aufnahmen anhand des Goldstandards für die mikroskopische Blutflussbildgebung in vivo, TPLSM.
Kompetente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde durch einen Research Initiative Award der American Epilepsy Society und einen Preis der Arizona Biomedical Research Commission an S.L.M. sowie durch einen Challenge Grant von Research to Prevent Blindness Inc. an die Abteilung für Ophthalmologie an der SUNY Downstate Health Sciences University, das New York State Empire Innovation Program, finanziert. und weitere Zuschüsse von der National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), der Barrow Neurological Foundation, Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton und Dignity Health SEED Awards sowie von Bundeszuschüssen der National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) und des National Institute of Health (Auszeichnungen R01EY031971 UND R01CA258021) an S.L.M. und S.M.C. Diese Arbeit wurde auch vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs unter Award No. W81XWH-15-1-0138, nach S.L.M.. L.-C. wurde durch ein José Castillejo-Stipendium des spanischen Bildungsministeriums unterstützt. Wir danken O. Caballero und M. Ledo für ihre technische Beratung und Unterstützung.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
