Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées
Summary
Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.
Abstract
L’objectif de ce protocole est de décrire l’endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des faisceaux de fibres optiques (pCLE) dans son application spécifique pour élucider les effets du flux sanguin capillaire pendant les crises, entraînés par les cellules murales. L’imagerie corticale in vitro et in vivo a montré que les constrictions capillaires induites par les péricytes peuvent résulter d’une activité neuronale locale fonctionnelle, ainsi que de l’application de médicaments, chez des animaux sains. Ici, un protocole est présenté sur la façon d’utiliser la pCLE pour déterminer le rôle de la dynamique microvasculaire dans la dégénérescence neurale dans l’épilepsie, à n’importe quelle profondeur tissulaire (en particulier dans l’hippocampe). Nous décrivons une technique d’appuie-tête qui a été adaptée pour enregistrer la pCLE chez les animaux éveillés, afin de traiter les effets secondaires potentiels des anesthésiques sur l’activité neuronale. Grâce à ces méthodes, des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie peuvent être effectués pendant plusieurs heures dans les structures neuronales profondes du cerveau.
Introduction
Contrairement à d’autres méthodes d’imagerie microscopique 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopie confocale in vivo à base de fibres optiques permet de mesurer la dynamique du flux sanguin dans n’importe quelle région du cerveau, à n’importe quelle profondeur, à grande vitesse (jusqu’à 240 Hz selon la taille du champ de vision9). Une sonde à fibre optique permet l’imagerie confocale à balayage laser in vivo à une résolution de 3 μm, car la pointe de la sonde (un objectif sans lentille composé d’un faisceau de 5000 à 6000 fibres individuelles de 3 μm de diamètre) peut être positionnée avec la précision d’une microélectrode, à moins de 15 μm de la cible fluorescente d’intérêt. Comme pour l’imagerie in vivo à deux photons, les fluorophores doivent être préalablement introduits dans la cible d’imagerie. Par exemple, du dextran de fluorescéine (ou des points quantiques) peut être injecté dans le système vasculaire, ou des protéines fluorescentes génétiquement codées peuvent être transfectées dans les cellules, ou des colorants fluorescents tels que le vert d’Oregon BAPTA-1 peuvent être chargés en vrac dans les cellules, avant l’imagerie.
Des recherches récentes utilisant ces techniques ont montré que l’activité motrice des cellules murales conduisant à des vasospasmes capillaires ictaux – des constrictions soudaines qui se produisent à la position des cellules murales pendant les crises 9 – peut contribuer à la neurodégénérescence de l’hippocampe ictal9. Alors que des études d’imagerie antérieures ont montré des constrictions péricytaires in vitro et in vivo liées à des applications médicamenteuses 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. ont trouvé la première preuve de constrictions capillaires spontanées in vivo dans le cerveau murin. Pour établir la pertinence de l’épilepsie du lobe temporal humain, ils ont étudié des souris mâles (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), un modèle génétique de l’ataxie épisodique humaine de type 115. Les péricytes ont entraîné des vasoconstrictions murales de l’hippocampe pathologiques et physiologiques9 chez les animaux spontanément épileptiques et leurs compagnons de portée de type sauvage (WT). Ces observations ont été reproduites chez des animaux WT rendus épileptiques avec de l’acide kaïnique, indiquant ainsi leur généralisation à d’autres formes d’épilepsie. Leal-Campanario et al. ont en outre déterminé, à l’aide de nouvelles approches de microscopie stéréologique, que les neurones apoptotiques – mais pas sains – chez les animaux épileptiques étaient spatialement couplés à la microvascularisation de l’hippocampe. Étant donné que l’excitotoxicité n’a pas d’association spatiale connue avec le système vasculaire, ce résultat indique que l’hypoxie anormale induite par l’ischémie vasospasmique capillaire anormale contribue à la neurodégénérescence dans l’épilepsie. La figure 1 montre un schéma de la configuration générale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons mis au point un système de retenue de la tête pour des expériences simultanées de pCLE électrophysiologique et à fibre optique chez des souris éveillées, réduisant ainsi la contamination potentielle de la réponse due aux médicaments anesthésiques. Le capuchon de tête et l’appareil de montage sont simples à construire et sont réutilisables pour les expériences d’imagerie chronique au comportement éveillé. Nous avons vérifié la qualité des enregistrements par rapport à l’étalon-or de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet a été financé par un prix de l’initiative de recherche de l’American Epilepsy Society et un prix de la Commission de recherche biomédicale de l’Arizona à S.L.M., ainsi qu’une subvention de défi de Research to Prevent Blindness Inc. au département d’ophtalmologie de l’Université des sciences de la santé de l’État de New York, le programme d’innovation Empire de l’État de New York. et d’autres subventions de la National Science Foundation (0726113, 0852636 et 1523614), de la Barrow Neurological Foundation, de Mme Marian Rochelle, de Mme Grace Welton et des prix SEED de Dignity Health, et de subventions fédérales de la National Science Foundation (0726113, 0852636 et 1523614) et de l’Institut national de la santé (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), à S.L.M et S.M.C. Ce travail a également été soutenu par le Bureau du secrétaire adjoint à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du prix No. W81XWH-15-1-0138, à S.L.M. L.-C. a bénéficié d’une bourse José Castillejo du ministère espagnol de l’Éducation. Nous remercions O. Caballero et M. Ledo pour leurs conseils techniques et leur assistance.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
