In vivo vezelgekoppelde preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE) van hippocampuscapillairen bij wakkere muizen
Summary
Terwijl multifotonenbeeldvorming alleen effectief is op beperkte diepten van het weefseloppervlak, is het mogelijk om via pCLE op elke diepte beeldvorming met een resolutie van 3 μm te bereiken. Hier presenteren we een protocol om pCLE-beeldvorming uit te voeren om de microvasculaire dynamiek in de hippocampus van ictale en wildtype muizen te meten.
Abstract
Het doel van dit protocol is het beschrijven van fiber-optic-bundel-gekoppelde preklinische confocale laser-scanning endomicroscopie (pCLE) in zijn specifieke toepassing om capillaire bloedstroomeffecten tijdens aanvallen, aangedreven door murale cellen, op te helderen. In vitro en in vivo corticale beeldvorming heeft aangetoond dat capillaire vernauwingen aangedreven door pericyten het gevolg kunnen zijn van functionele lokale neurale activiteit, evenals van het toedienen van geneesmiddelen bij gezonde dieren. Hier wordt een protocol gepresenteerd over het gebruik van pCLE om de rol van microvasculaire dynamiek bij neurale degeneratie bij epilepsie te bepalen, op elke weefseldiepte (met name in de hippocampus). We beschrijven een hoofdsteuntechniek die is aangepast om pCLE bij wakkere dieren vast te leggen, om mogelijke bijwerkingen van anesthetica op neurale activiteit aan te pakken. Met behulp van deze methoden kunnen elektrofysiologische en beeldvormende opnames gedurende enkele uren worden uitgevoerd in diepe neurale structuren van de hersenen.
Introduction
In tegenstelling tot andere microscopische beeldvormingsmethoden 1,2,3,4,5,6,7,8, maakt confocale microscopie op basis van glasvezel in vivo het mogelijk om de dynamiek van de bloedstroom in elk hersengebied, op elke diepte, met hoge snelheid te meten (tot 240 Hz, afhankelijk van de grootte van het gezichtsveld9). Een glasvezelsonde maakt in vivo confocale laserscanbeeldvorming mogelijk met een resolutie van 3 μm, omdat de punt van de sonde (een lensloos objectief dat bestaat uit een bundel van 5000-6000 individuele vezels met een diameter van 3 μm) kan worden gepositioneerd met de nauwkeurigheid van een micro-elektrode, binnen 15 μm van het fluorescerende doel van belang. Net als bij in vivo beeldvorming met twee fotonen, moeten fluoroforen vooraf in het beeldvormingsdoel worden geïntroduceerd. Fluoresceïne-dextran (of kwantumdots) kunnen bijvoorbeeld in het vaatstelsel worden geïnjecteerd, of genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten kunnen in cellen worden getransfecteerd, of fluorescerende kleurstoffen zoals Oregon Green BAPTA-1 kunnen in bulk in cellen worden geladen, voorafgaand aan beeldvorming.
Recent onderzoek met behulp van deze technieken heeft aangetoond dat motorische activiteit van muurcellen die leidt tot ictale capillaire vasospasmen – plotselinge vernauwingen die optreden op de positie van de muurcellen tijdens aanvallen 9 – kan bijdragen aan neurodegeneratie in de ictale hippocampus9. Terwijl eerdere beeldvormende studies in vitro en in vivo pericytenvernauwingen aantoonden die verband hielden met medicijntoepassingen 6,7,10,11,12, vonden Leal-Campanario et al. het eerste bewijs van in vivo spontane capillaire vernauwingen in de muizenhersenen. Om de relevantie voor epilepsie van de menselijke temporale kwab vast te stellen, bestudeerden ze mannelijke (P30-40 oude) knock-out (KO) Kv1.1 (kcna1-null) muizen 14,15 (JAX-voorraad #003532), een genetisch model van menselijke episodische ataxie type 115. Pericyten veroorzaakten zowel pathologische als fysiologische hippocampale muurschildering vasoconstricties9 bij de spontaan epileptische dieren en hun wild-type (WT) nestgenoten. Deze waarnemingen werden gerepliceerd bij WT-dieren die epileptisch waren gemaakt met kaininezuur, wat wijst op hun generalisatie naar andere vormen van epilepsie. Leal-Campanario et al. stelden bovendien vast, met behulp van nieuwe stereologische microscopiebenaderingen, dat apoptotische – maar niet gezonde – neuronen in epileptische dieren ruimtelijk gekoppeld waren aan de hippocampusmicrovasculatuur. Omdat excitotoxiciteit geen bekende ruimtelijke associatie heeft met het vaatstelsel, gaf dit resultaat aan dat abnormale capillaire vasospasmische ischemie-geïnduceerde hypoxie bijdraagt aan neurodegeneratie bij epilepsie. Figuur 1 toont een schema van de algemene opstelling.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een hoofdkapfixatiesysteem voor gelijktijdige elektrofysiologische en glasvezel pCLE-experimenten bij wakkere muizen, waardoor mogelijke responsbesmetting als gevolg van anesthetica wordt verminderd. De hoofdkap en het montageapparaat zijn eenvoudig te construeren en zijn herbruikbaar voor chronisch wakker gedragende beeldvormingsexperimenten. We hebben de kwaliteit van de opnames getoetst aan de gouden standaard voor in vivo microscopische bloedstroombeeldvorming, TPLSM.
Bekwa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project werd gefinancierd door een Research Initiative Award van de American Epilepsy Society en een prijs van de Arizona Biomedical Research Commission aan S.L.M., evenals een uitdagingssubsidie van Research to Prevent Blindness Inc. aan de afdeling Oogheelkunde van de SUNY Downstate Health Sciences University, het New York State Empire Innovation Program, en verdere subsidies van de National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), de Barrow Neurological Foundation, mevrouw Marian Rochelle, mevrouw Grace Welton en Dignity Health SEED-prijzen, en door federale subsidies van de National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) en door het National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), aan SLM en SMC. Dit werk werd ook ondersteund door het Bureau van de adjunct-secretaris van Defensie voor Gezondheidszaken onder Award No. W81XWH-15-1-0138, naar S.L.M. L.-C. werd ondersteund door een José Castillejo-beurs van het Spaanse Ministerie van Onderwijs. Wij danken O. Caballero en M. Ledo voor hun technisch advies en assistentie.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
