Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

Condición de la cultura Línea celular de hTERT RPE-1 fue cultivado en modificado Eagle Medium de Dulbecco (Tabla de materiales) suplementado con 10% Suero Fetal Bovino y 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C con 5% CO2 en un ambiente humidificado. El protocolo que se describe a continuación ha sido desarrollado utilizando platos de 10 cm y todos los datos técnicos registrados se refieren a los platos. Si utiliza platos diferentes, la escala hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. 1. sincronización de las células RPE-1 Utilice las células recién descongeladas que no han sufrido más de 15 pasos para todos los experimentos. El día 1, descongelar y dispensar ~2.5 – 5.0 x 105 1 RPE células hTERT en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm. Añada 8 mL de medio de cultivo estándar e incubar durante la noche. Determinar el número de celular utilizando un contador de célula estándar (por ejemplo un hemocitómetro).Nota: La densidad celular se refiere a condiciones de crecimiento de las células RPE-1. Condiciones de crecimiento pueden variar entre diferentes líneas celulares; considerar ajuste en consecuencia. En el día 2, sincronizar las células en la frontera de G1/S aspiración medio de crecimiento regular y añadiendo medio 8 mL que contiene timidina 5 mM.Nota: Concentración de timidina y la duración del tratamiento pueden variar a través de diferentes líneas celulares. Es recomendable realizar experiencias piloto para determinar las mejores condiciones para las líneas de la célula ser probado. El día 3, 24 h después de agregar el medio timidina (paso 1.2), lanzamiento del bloque de la timidina por medio de aspiración y lavar las células 3 veces con PBS 1 x. Añada 8 mL de medio de crecimiento regular y devolver las placas a la incubadora. 2. generación de aneuploides células por interferencia con la actividad de la quinasa mitótica Mps1 El día 3, 6 h después del lanzamiento del bloque de la timidina (paso 1.3; Esto es aproximadamente 3-6 h antes de entrar en las células de mitosis), medio de aspirar, lavar una vez con PBS 1 x y reemplazar con medio que contiene 500 nM reversine (inhibidor de la Mps1).Nota: Entrar en las células RPE 1 mitosis 9-12 h después de timidina lavado10,11. Sin embargo, cinética del ciclo celular varía entre diferentes líneas celulares. Por lo tanto, es crucial para determinar las cinéticas en experiencias piloto mediante la realización de análisis de ciclo celular por métodos establecidos (p. ej., mediante la medición de DNA contenido vía FACS análisis). Además, la concentración de trabajo óptimo de inhibidor de la Mps1 puede variar entre las líneas celulares. Experimentos anteriores con células RPE1 han tenido éxito usando reversine en una concentración de trabajo de 500 nM10,11,12. Es recomendable realizar experiencias piloto para determinar la concentración óptima para la línea celular a probarse. El día 4, 12 h después del tratamiento de reversine (aproximadamente 6 h después de las células en mitosis), reversine medio de aspirar y lavar las células 3 veces con PBS 1 x. Añada 8 mL regular crecimiento medio a la placa y volver a las células a la incubadora. 3. eliminación de células aneuploides ciclismo y enriquecimiento de la población de ArCK El día 6, unos 72 h después de entrar en las células de la primera mitosis (paso 2.2; Esto es unos 66 horas después de reversine lavado-hacia fuera, que corresponde a unos 2-3 ciclos de la célula), medio de aspirar, lavar una vez con PBS 1 x y sustituir con medio que contiene 300 nM nocodazole.Nota: El trabajo reciente ha demostrado que las células RPE-1 que los cariotipos aneuploides son genómicamente inestables y detención su proliferación sobre 2-3 ciclos de celular después de las primeras mitosis defectuosa10. Sin embargo, esta cinética puede variar entre diferentes líneas celulares. Por lo tanto, es crucial para llevar a cabo experiencias piloto para determinar el tiempo adecuado para la eliminación de células aneuploides de ciclismo. En el día 7, 12 h después del tratamiento del nocodazole, Aspire mediano y añadir 3 mL de 1 x PBS a la placa. Sacudir las células mitotic golpeando el lado de la placa. Gire la placa entre cada golpecito para permitir incluso eliminación de las células mitotic. Para asegurar la completa eliminación de las células mitotic, repita el proceso de batido para múltiples rondas (3 – 5 veces recomendados), aspirando y agregar 3 mL de 1 x PBS entre cada ronda. Tras sacudir, aspirar suavemente cualquier líquido que se adherido a la tapa o el borde de la placa. Brevemente, Compruebe la placa bajo un microscopio con un aumento X 10. Asegurar que se observan pocas células mitóticas. Si más de cinco células mitóticas se observan con objetivo de 10 X, repita otra ronda de shake.Nota: Las células Mitotic aparecen redondeadas y pueden ser parcialmente separadas tras Agitar. Es crucial para asegurar la eliminación completa de células mitóticas antes de exponer las células a la siguiente ronda del nocodazole tratamiento. No hacerlo puede conducir a la muerte celular mitótica o resultar en la generación de células tetraploides. Tras final sacudir, lavar las células una vez con 5 mL de PBS 1 x. Añadir a medio 8 mL que contiene 330 nM nocodazole en la placa e incubar durante 12 h. Repita nocodazole tratamiento/shake-off (pasos 3.1-3.5) cada 12 h hasta que no las células mitóticas se observan después de la incubación. Por lo general, se recomiendan 4-5 rondas de tratamiento/shake.Nota: La información proporcionada aquí consulte las células RPE-1. El número de rondas de tratamiento/shake puede variar entre diferentes líneas celulares. Para evitar la exposición prolongada e innecesaria para nocodazole es crucial para determinar cuidadosamente, en un experimento piloto, el número de rondas necesarias para la eliminación eficaz y completa de células aneuploides de ciclismo. Después de 4-5 rondas de nocodazole tratamiento/shake (pasos 3.1-3.6), añadir 10 mL de medio de crecimiento regular e incubar. Deje reposar 12-24 h antes de su uso futuro de manipulación o ensayo de las células.Nota: Tras última sacudida, las células restantes de la placa son ciclo celular detenido y, como se muestra recientemente10, albergan los karyotypes complejos. Estas células se denominan células de ArCK (detenido con cariotipo complejo). Es recomendable realizar ensayos en las poblaciones de ArCK dentro de una semana de aislamiento. Opcionalmente, para evaluar el porcentaje de células detenidas con los karyotypes complejos, recoger y contar las células de cada batido usando un contador de células estándar. Figura 1: esquema general del método utilizado para generar y aislar células aneuploides con cariotipo complejo (ArCK) e imágenes representativas. (A) esquema de ArCK células protocolo de generación y el aislamiento. (B) imágenes representativas de RPE-1 células de hTERT en cada etapa del tratamiento. El último panel (contorneado en color rojo) representa las células aisladas de ArCK. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Caracterización de la población de ArCK Confirman aislamiento exitoso de ArCK población mediante la realización de los ensayos siguientes. Valorar beta-galactosidasa (el marcador de la senescencia) de tinción utilizando comercialmente disponible kit (véase tabla de materiales). Medida la secreción de citoquinas proinflamatorias, como CCL2, mediante el empleo de kits disponibles en el mercado (véase tabla de materiales). Confirman el aumento de los niveles del ciclo celular inhibidores p53, p21, p16 por Western Blot.Nota: Para controlar adecuadamente estos ensayos, ArCK poblaciones deben ser comparadas con células ciclismo euploides y aneuploides. El primero es paso bajo, tipo RPE-1 hTERT células creciendo exponencialmente. Este último puede obtenerse induciendo mala segregación cromosómica en RPE-1 hTERT y cosechar las células 72 h después de la primera mitosis aberrante. Para ello, siga el protocolo descrito por encima de las células de 1.1 y de la cosecha de paso justo antes del primer tratamiento nocodazole (paso 3.1). Realizar secuenciación unicelular para evaluar el cariotipo de las células detenidas.Nota: La secuencia sola célula es un método bien establecido para determinar los cambios cromosómicos y las cromosómicos a través de una población celular en el nivel unicelular13. Los procedimientos detallados de cómo realizar la secuencia sola célula pueden encontrarse en otra parte10.