Summary

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Published: March 23, 2018
doi:

Summary

Descriviamo la fissazione, inclusione in paraffina e sottili tecniche di sezionamento per colonie microbiche biofilm. In campioni preparati, modelli di espressione di sottostruttura e reporter di biofilm possono essere visualizzati da microscopia.

Abstract

Sezionamento tramite inclusione in paraffina è una tecnica ampiamente consolidata in sistemi eucariotici. Qui forniamo un metodo per la fissazione, l’incorporamento e sezionamento dei biofilm intatto di colonie microbiche utilizzando irrorato di cera di paraffina. Per adattare questo metodo per l’utilizzo su biofilm di Colonia, abbiamo sviluppato le tecniche per mantenere ciascun campione il suo substrato di crescita e di esso di laminazione con un strato di agar e aggiunto alla soluzione fissante lisina. Queste ottimizzazioni migliorano la conservazione del campione e mantenimento delle caratteristiche di micromorphological. Campioni preparati in questo modo sono favorevoli a sottile di sezionamento e di imaging da microscopia elettronica di trasmissione, fluorescenza e della luce. Abbiamo applicato questa tecnica a Colonia biofilm di Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. L’elevato livello di dettaglio visibile in campioni generati da questo metodo, combinato con ceppo reporter ingegneria o l’uso di coloranti specifici, può fornire spunti interessanti sulla fisiologia e sullo sviluppo delle comunità microbiche.

Introduction

Maggior parte dei microbi hanno la capacità di forma biofilm, comunità di cellule tenute insieme da matrici autoprodotti. I biofilm possono essere coltivati in molti tipi di configurazioni fisiche, con vari regimi di fornitura di nutrienti e substrato. Test specifici per la formazione di biofilm tendono a produrre strutture multicellulari riproducibile e architetture comuni sono osservate per specie filogeneticamente diversificata a livello macroscopico o comunità. Quando i microbi vengono coltivati come colonie su terreno solido sotto atmosfera, morfologia macroscopica trasmette informazioni sulla capacità per la produzione della matrice e spesso correla con altri tratti 1,2,3. L’architettura interna di colonie microbiche possa anche fornire indizi riguardo specifici del biofilm chimica e fisiologia, ma è stato difficile da caratterizzare. Recenti applicazioni delle tecniche di crioinclusione e cryosectioning di colonie batteriche hanno permesso la formazione immagine e la visualizzazione di specifiche caratteristiche a risoluzione senza precedenti 4,5,6. Tuttavia, studi con tessuto animale hanno dimostrato che inclusione in paraffina fornisce superiore conservazione della morfologia rispetto a crioinclusione 7 e viene utilizzato per visualizzare i batteri in tessuti 8,9. Abbiamo pertanto sviluppato un protocollo per la fissazione, inclusione in paraffina e sezionamento sottile di colonie microbiche biofilm. Qui, descriviamo la preparazione di Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm sezioni sottili 10,11, ma abbiamo applicato con successo anche questa tecnica a biofilm formato dai batteri Synxantha Pseudomonas, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae12.

Il processo di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento biofilm segue una logica semplice. In primo luogo, il biofilm sono racchiusi in uno strato di agar per preservare la morfologia durante l’elaborazione. In secondo luogo, il biofilm racchiusi sono sommerse in un fissativo di crosslink macromolecole e preservare micromorfologia. Questi sono poi disidratati con alcool, ha eliminati con un solvente non polare più e quindi infiltrati con cera di paraffina liquida. Una volta infiltrato, i campioni sono incorporati in mattoncini di cera per il sezionamento. Sezioni sono tagliati, montate su slitte e poi reidratati al fine di riportarli a uno stato più nativo. Da questo punto, possono essere macchiati o coperto in mezzo di montaggio per l’analisi al microscopio.

Questo protocollo produce sezioni sottili di biofilm microbici adatto per l’analisi istologica. Sottostrutture di biofilm di Colonia sono visibili quando sezioni sottili preparati utilizzando questo metodo sono immaginate da microscopia chiara. Biofilm possono essere anche coltivati sulle macchie fluorescenti contenenti supporti specifici per le singole funzionalità o macchiati nella fase di reidratazione, immediatamente prima del montaggio (passaggi 9.5-9.6). Infine, i microbi possono essere progettati per produrre proteine fluorescenti in modo costitutivo o regolamentato, permettendo in caso di segnalazione in situ di espressione di gene o distribuzione delle cellule all’interno di queste comunità. Abbiamo usato questi metodi per determinare la profondità di biofilm di Colonia, distribuzione delle cellule, distribuzione della tabella, modelli di crescita ed espressione genica spatiotemporal.

Protocol

1. crescita di Pseudomonas aeruginosa Colonia biofilm Preparazione delle piastre Medium-Bilayer Preparare un tryptone di 10 g/L, agar 10 g/L (Vedi Tabella materiali) soluzione in acqua deionizzata. Autoclave per raffreddare a 50-60 ° C per 20 min. in un bagno d’acqua. Versare 45 mL della soluzione di agar-tryptone in un piatto quadrato 100 x 100 mm (Vedi Tabella materiali) utilizzando una provetta conica da 50 mL. Consentire l’agar solidificare (~…

Representative Results

Questo metodo genera sottili sezioni di biofilm in cui le caratteristiche morfologiche distinte e zone di espressione genica possono essere ripreso da DIC, microscopia a fluorescenza e TEM. Mentre imaging DIC utilizzando un 40 X obiettivo a immersione in olio può essere sufficiente a mostrare alcune caratteristiche morfologiche (Figura 2E), abbiamo trovato quello fluorescenza microscopia di ceppi ingegnerizzati per proteina costitutivamente espresso fluoresc…

Discussion

Campioni di tessuto di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento è una tecnica istologica classica che permette l’imaging delle strutture micro-morfologica e viene comunemente utilizzata sui tessuti negli eucarioti è stata applicata con successo ai campioni microbici8 ,9. Mentre crioinclusione consente una forte ritenzione del segnale endogeno ed immunofluorescente, inclusione in paraffina è generalmente preferibile in quanto fornisce migliore conservazi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NSF carriera premio 1553023 e premio NIH/NIAID R01AI103369.

Materials

5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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