Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse
Summary
Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.
Abstract
Über Paraffin einbetten-Schnitt ist eine weitgehend etablierte Methode in eukaryontischen Systemen. Hier bieten wir eine Methode zur Fixierung, einbetten und intakte mikrobielle Kolonie Biofilme mit perfundierten Paraffin-Wachs-Schnitt. Um diese Methode für den Einsatz auf Kolonie Biofilme anzupassen, wir entwickelten Techniken für die Pflege jedes Sample auf seine Wachstumssubstrat und mit einer Agar-Overlayer Laminieren und Lysin Fixativ Projektmappe hinzugefügt. Diese Optimierungen verbessern Probe Aufbewahrung und Erhaltung der mikromorphologischer Funktionen. Proben, die auf diese Weise zubereitet sind dünn schneiden und Bildgebung durch Licht, Fluoreszenz, und Transmissionselektronenmikroskopie zugänglich. Wir haben diese Technik auf Kolonie Biofilmen von Pseudomonas Aeruginosa, Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilisund Vibrio Choleraeangewandt. Das hohe Niveau der Details sichtbar in Proben von dieser Methode generiert kombiniert mit Reporter Stamm Engineering oder die Verwendung von bestimmten Farbstoffen, bieten spannende Einblicke in die Physiologie und Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften.
Introduction
Die meisten Mikroben haben die Fähigkeit, Form Biofilme, zusammengehalten Gemeinschaften von Zellen durch selbst erstellte Matrizen. Biofilme können in vielen Arten von physischen Setups mit verschiedenen Regimen Nährstoff- und Substrat Bestimmung angebaut werden. Spezifischen Assays für die Biofilmbildung tendenziell reproduzierbare vielzellige Strukturen ergeben, und gemeinsame Architekturen für phylogenetisch Artenvielfalt auf der makroskopischen Ebene oder Gemeinschaft eingehalten werden. Wenn Mikroben als Kolonien auf festem Medium unter Atmosphäre gewachsen sind, makroskopische Morphologie vermittelt Informationen über die Kapazität für die Produktion von Matrix und oft korreliert mit anderen Eigenschaften 1,2,3. Die interne Architektur der mikrobiellen Kolonien liefern auch Hinweise auf Biofilm-spezifische Chemie und Physiologie, aber schwer zu charakterisieren. Aktuelle Anwendungen von Cryoembedding und Kryoschneiden Techniken zu Bakterienkolonien ermöglichten Bildgebung und Visualisierung von Besonderheiten in noch nie da gewesenen Auflösung 4,5,6. Studien mit tierischem Gewebe haben jedoch gezeigt, dass Paraffin einbetten bietet hervorragende Erhaltung der Morphologie im Vergleich zu Cryoembedding 7 und verwendet wurde, um Bakterien im Gewebe 8,9zu visualisieren. Deshalb haben wir ein Protokoll zur Fixierung, Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen entwickelt. Hier beschreiben wir die Vorbereitung von Pseudomonas Aeruginosa PA14 Kolonie-Biofilm Dünnschliffe 10,11, aber wir haben diese Technik Biofilme bilden die Bakterien auch erfolgreich angewendet Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilis, und Vibrio Cholerae12.
Der Prozess von Paraffin einbetten und dünn schneiden Biofilmen folgt einer einfachen Logik. Erstens sind die Biofilme in einer Schicht von Agar, Morphologie während der Verarbeitung zu bewahren umhüllt. Zweitens die eingehüllte Biofilme sind eingetaucht in ein Fixiermittel, Crosslink Makromoleküle und Mikromorphologie bewahren. Diese sind dann mit Alkohol dehydriert, mit einem nicht-polaren Lösungsmittel gelöscht und dann mit flüssigem Paraffin Wachs infiltriert. Sobald infiltriert, sind die Proben eingebettet in Wachs Blöcke für schneiden. Abschnitte sind geschnitten, montiert auf Folien und dann rehydriert um mehr nativen Zustand zurücksenden. Ab diesem Zeitpunkt können sie gebeizt oder in Eindeckmedium für die mikroskopische Analyse abgedeckt.
Dieses Protokoll produziert Dünnschliffe von mikrobiellen Biofilmen für histologische Analyse geeignet. Kolonie Biofilm Unterkonstruktionen sind sichtbar, wenn Dünnschliffe vorbereitet, mit dieser Methode durch Lichtmikroskopie abgebildet werden. Biofilme können auch auf Medien mit fluoreszierenden Flecken angebaut werden spezifisch für einzelne Features oder gebeizt Rehydratation Schritt unmittelbar vor der Montage (Schritte 9.5 9.6). Zu guter Letzt können Mikroben entwickelt werden, um fluoreszierende Proteine in einer konstitutiven oder regulierten Mode ermöglicht Berichten in Situ Zelle Verteilung oder Gen-Ausdrucks innerhalb dieser Gemeinschaften zu produzieren. Wir haben diese Methoden verwendet, um Kolonie Biofilm Tiefe, Zelle Verteilung Matrix Verteilung, Wachstumsmuster und raumzeitlichen Genexpression zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einbetten von Paraffin und dünn schneiden Gewebeproben ist eine klassische histologische Technik, die ermöglicht die Abbildung von Mikro-morphologische Strukturen und wird häufig auf eukaryotischen Geweben verwendet und mit einigem Erfolg auf mikrobielle Proben8 angewendet wurde ,9. Während Cryoembedding für die starke Bindung des endogenen und immunofluorescent Signals ermöglicht, ist Paraffin einbetten generell vorzuziehen, da sie besseren Schutz der Mor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NSF-Karriere-AWARD-1553023 und NIH/NIAID Award R01AI103369 unterstützt.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
