Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Secuenciación del RNA análisis del transcriptoma de los ganglios linfáticos proporciona la oportunidad de caracterizar la respuesta inmune de los animales a una variedad de patógenos. Si bien esta metodología se ha utilizado extensivamente en ratones, análisis han ampliado recientemente en grandes mamíferos^1,2. Ganadería y grandes ganglios animal puede utilizarse para caracterizar las respuestas de host a una infección, no sólo para su uso en vacunas o estudios de susceptibilidad genética y para la identificación de dianas para el desarrollo de fármacos, sino también como sistemas modelo para estudios en seres humanos en las enfermedades zoonóticas. Por ejemplo, en el caso de brucelosis (una enfermedad bacteriana zoonótica que impactos de medio millón personas alrededor del mundo cada año), a pesar de aumentó significativamente los costos de estudios en ovejas o cabras son más relevantes a la infección humana y vacunas humanas desarrollo de modelos animales de laboratorio. Modelos de infección del ratón recapitulan la infección del sistema reticuloendotelial, pero no los signos clínicos característicos³_.

En experimentos con animales grandes en comparación con los estudios animales de laboratorio, el proceso de tejido recolección necesariamente implica un retraso largo entre la eutanasia y la colección de tejidos, que presenta un desafío potencial para la conservación de ARN de alta calidad. ARN intacto es esencial para la generación de datos transcriptómicos biológicamente relevantes. La generación de ARN de alta calidad de las muestras de tejido es particularmente crítica para estudios de patógeno animal grande llevó a cabo en las instalaciones de contención. Tales estudios son inherentemente más difíciles de realizar ya que no sólo requieren aprobado instalaciones y con personal altamente capacitado, sino también llevan costos financieros significativos, que, dependiendo de la obra, pueden variar desde decenas hasta cientos de miles de dólares. Este tipo de estudios también implica una colaboración interdisciplinaria y conocimiento interdisciplinario para su terminación, añadiendo a su complejidad. Por lo tanto, entrenamiento, desarrollo de y la adherencia a un sistema simplificado para la recogida de muestras y conservación proporciona ventajas significativas para posteriores estudios moleculares de los tejidos de animales infectados.

La colección más grandes de nodos de linfa presenta retos adicionales para la colección de tejido en comparación con la toma de muestras similar de ganglios murinos. La preparación para la supresión de la muestra requiere un entendimiento básico de la anatomía de los ganglios linfáticos, incluyendo las estructuras internas pertinentes. La estructura de un nodo de linfa se compone de lobulillos linfoides rodeados por senos llenados de linfa. Estas estructuras están encerradas dentro de una cápsula resistente, fibrosa. ⁴ un lóbulo linfoide es la “base anatómica y funcional unidad del ganglio linfático” y se compone de folículos, una unidad profunda cortical y cordones medulares y senos paranasales⁴ (figura 1A). Los linfocitos B y T son el hogar de los folículos y profundidad corticales unidades, respectivamente. Estas estructuras proporcionan un andamio 3D y facilitan la interacción entre los linfocitos y el antígeno o células presentadoras de antígeno.

Grueso, folículos y unidades de profundidad corticales pueden ser identificadas en superficie del corte ya que contienen una red reticular densa y aparecen más oscuros que los senos paranasales, que están compuestos por una red reticular más delicada y aparecen más ligeros (figura 1B). Por Convención, patólogos se refieren a las regiones de los ganglios linfáticos como la corteza superficial (folículos), el paracortex (unidades de profundidad corticales) y la médula (cordones medulares y los senos paranasales). Un examen adecuado de las tres regiones se ha considerado como la mejor práctica en pautas de rutina examinación patológica de ganglios⁵. Tenga en cuenta que existe una considerable variación en la consistencia, tamaño y color de los ganglios linfáticos, incluso dentro de un solo animal. Edad de los animales, sus nodos de linfa tenderá a disminuir en tamaño y ser más firme que los de animales más jóvenes, generalmente debido a un aumento en su tejido conectivo y una reducción del linfoide normal estructura^6,7.

Figura 1. Anatomía de los ganglios linfáticos. (A) esta caricatura muestra la anatomía de los ganglios linfáticos, estructuras claves. (B) todavía la imagen muestra un nodo de linfa bovino cortado transversalmente. Se destacan las estructuras pertinentes/capas que son visibles a simple vista. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dependiendo de la pregunta experimental, diversos ganglios linfáticos será de interés para la recolección y análisis. Los ganglios linfáticos periféricos son los situados profundamente en el tejido subcutáneo. En el ganado, los ganglios linfáticos periféricos o superficiales de uso frecuente en la práctica clínica y experimental incluyen parótida, submaxilar, retrofaríngeo, preescapular, prefemoral (precrural) y superficial inguinal (supramamaria en escrotal en los machos de las hembras) () Figura 2). En la tabla 1, las propiedades de los principales ganglios linfáticos superficiales, como se describe en el sistema de ganados⁸, se describen. A continuación, se presentan algunas posibles planes de colección de nodo de linfa para enfermedades infecciosas bacterianas del ganado como punto de partida para la investigación.

Brucella abortus/Brucella melitensis: estándar de necropsias para B. abortus-infectado ganados y B. melitensis-cabras infectadas en el Centro Nacional de enfermedad Animal recuperan supramamaria prescapular y tejido ganglionar parotidea , tanto para la molienda para la enumeración bacteriana y para la preparación de RNA para los perfiles de expresión de RNA del anfitrión. B. abortus puede recuperarse regularmente en cada uno de estos nodos de linfa en bovinos experimentalmente infectados⁹_. La presencia de bacterias en cada uno de estos tipos de nodo de linfa puede detectarse en B. melitensis-infectados cabras hasta infección posterior por lo menos nueve meses usando las metodologías basadas en RNA de nuestros estudios (Boggiatto et al., inédito). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), y nodos de linfa mesentéricos han sido útiles durante la elaboración de perfiles de las canales de ganado para una prevalencia de Salmonella ^10,11,12 y sería de interés potencial para estudios transcriptómico. E. coli O157: H7: nodos de linfa mesentéricos (en el intestino medio e intestino delgado distal) pueden ser los sitios de una recuperación ocasional de la bacterias en terneros infectados (pero no en ganado adulto infectado)¹³. Leptospirosis (Leptospira SP.): una crónica persistencia de la bacteria se ha observado en los ganglios linfáticos que drenan la glándula mamaria¹⁴. Mycobacterium bovis : En el ganado, las bacterias han sido recuperada post experimental infección de los ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales de becerros¹⁵. Además, RNA del nodo de linfa se ha utilizado para examinar las respuestas de gran anfitrión animal al virus, como la del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino². Figura 2 muestra la ubicación de un subconjunto de estos grandes nodos de linfa en el cuerpo del ganado.

Figura 2: Dibujos que representan lugares seleccionados del nodo de linfa en Bos taurus . Los nodos de linfa números anotados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este artículo y el video asociado, se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes ganglios animal para estudios de RNA, diseñados para ser informativa para biólogos moleculares involucrados en estudios transcriptómicos de infecciones animales grandes. En primer lugar, ofrecemos un resumen del procedimiento de aislamiento para los nodos de linfa, usando el muestreo de tejidos bovinos y Bisonte como ejemplos. Junto con esta demostración, como se muestra en el video, es un flujo de trabajo para una muestra de tejido reproductivo para el aislamiento de RNA. A continuación, se describen consideraciones importantes para el procesamiento de un ganglio infectado, con un enfoque en calidad de RNA, consistencia y seguridad.

La preparación del ARN del tejido con un reactivo de isotiocianato de guanidina de fenol acidificado se basa en el original método de Chomczynski y Sacchi^16,17, con una purificación sobre columnas spin basados en sílice en presencia de caotrópico agentes basados en la obra original de Vogelstein y Gillespie¹⁸. También examinamos el potencial para la recuperación del ARN para transcriptómica de los ganglios linfáticos de vacas conservada por métodos alternativos. Finalmente, exploramos el impacto de la variable tiempo en la calidad del RNA en necropsias de animales grandes, incluyendo un experimento representativo que representa el efecto de un aumento en el tiempo entre la eutanasia y el muestreo del perfil de RNA recuperado de bisonte y bovina de los nodos de linfa. Este artículo será útil no sólo para biólogos moleculares, pero también para veterinarios investigadores comenzar estudios transcriptómico.