コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

リンパ節のトランスクリプトームの RNA シーケンス解析は、様々 な病原体に動物の免疫応答を特徴付けるため機会を提供します。この方法は、マウスで広く利用されている、しながら解析最近大きい哺乳類^1,2に拡大しています。ワクチンや遺伝的感受性の研究での使用、医薬品開発、人間の研究のモデル系としてもターゲットの同定だけでなく、感染する宿主反応を特徴付ける家畜・大型動物リンパ節を使用できます。人獣共通感染症。たとえば、ブルセラ症 (人畜共通細菌性疾患、影響 50万の人々 世界中毎年)、場合にもかかわらず大幅コスト、羊の研究の増加やヤギ、ヒトへの感染とワクチンに関連します。動物実験よりも開発。マウス感染モデル要約細網内皮のシステム感染がないの特徴的な臨床症状³_.

実験動物学と比較して大規模な動物実験、必ずしも収穫組織のプロセスは、安楽死と保全の課題と潜在的な組織のコレクションとの間の遅延が長くなります高品質の RNA。そのまま RNA は生物学的に関連するトランスクリプトーム データの生成に不可欠です。組織サンプルからの高品質の RNA の生成は特に大きな動物病原体研究の重要で実施封じ込め設備。このような研究は施設を承認、高度訓練を受けた技術者を必要とするだけでなく、また、これは、作業に応じて、数百数千ドルの数十から範囲することができます重要な金融費用を運ぶように本質的により困難です。この種の研究は、分野横断的なコラボレーションと、完了すると、その複雑さに追加するための横断的知識もあります。したがって、トレーニングの開発とサンプル収集・保存のための合理化されたシステムへの付着大きなメリットをもたらします組織の下流の分子研究のため感染している動物から。

大きなリンパ節のコレクションは、マウスのリンパ節のようなサンプリングと比較して組織コレクションの追加課題を提示します。サンプルの切除のための準備は、関連する内部構造を含むリンパ節の解剖学の基本的な理解を必要とします。リンパ節の構造は、満ちているリンパ洞に囲まれたリンパ性小葉で構成されます。これらの構造は、堅い、繊維状のカプセルに含まれています。⁴リンパ性小葉は、「基本的な解剖学的および機能的な単位リンパ節」包、皮質深部ユニットと髄コードと副鼻腔⁴ (図 1 a) で構成されます。B および T リンパ球は、それぞれ卵胞と皮質深部の単位に家します。これらの構造は、3 D 足場を提供し、リンパ球と抗原抗原提示細胞の相互作用を容易にします。

肉眼的に, 卵胞と皮質深部単位上識別できること切断面と高密度細網の網目を含む副鼻腔はより繊細な細網網目から成るし、ライターが表示よりも暗く見えます (図 1 b)。慣例では、病理学者は浅野 (包), (皮質深部単位) 皮質髄質 (髄コードや副鼻腔) とリンパ節の領域を参照してください。すべての 3 つの地域の適切な検査はルーチン検査、病理組織学的リンパ節⁵指針の実践として最高と判断がされています。一貫性、サイズ、および 1 つの動物の中でも、リンパ節の色でかなり変動があることに注意してください。動物の年齢、サイズが小さくなり、若い動物のものより硬くなり、通常構造の結合組織と正常リンパ球の減少の増加のための^6,7がちで、リンパ節。

図 1.リンパ節の解剖学。(A) この漫画のイメージは、キー構造を描いたリンパ節の構造を示します。(B) この画像は、断面カット牛リンパ節を示しています。関連する構造/レイヤーは肉眼に目に見えるが強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

実験的質問によって収集および分析のための興味の別のリンパ節になります。末梢のリンパ節は、皮下の組織に深くあります。牛は臨床的および実験的練習でよく使用されます周辺機器または表在性のリンパ節、耳下腺、顎下腺、咽頭、prescapular、prefemoral (precrural) と浅鼠径 (女性、男性の陰嚢に supramammary) (図 2)。テーブル 1、キーの表在リンパ節のプロパティ牛のシステム⁸に示すとおりです。以下、牛の伝染性の細菌性疾患のいくつかの潜在的なリンパ節のコレクションの計画が、調査の出発点として掲載されています。

ブルセラ abortus/ブルセラ melitensis:菌の標準 necropsies-感染牛およびB. melitensis-国立動物病センターで感染した山羊 supramammary、prescapular、耳下腺リンパ節組織を回復、研磨細菌の列挙とホスト RNA 発現プロファイリングのための RNA の準備のための両方。実験感染牛⁹_.でこれらのリンパ節のそれぞれで菌を定期的にリカバリできます。B. melitensisでこれらのリンパ節の種類ごとの細菌の存在を検出できる-私たちの研究 (Boggiattoら、未発表) から RNA ベースの方法を使用して、少なくとも 9 ヶ月後感染までヤギを感染しています。サルモネラsp: prescapular、subiliac (prefemoral)、腸間膜リンパ節は、プロファイリングのサルモネラの有病率^10、11,12の家畜の死骸の中に有用されていると、トランスクリプトーム研究の潜在的な利益のでしょう。エシェリヒア属大腸菌 o157: h7: (中間の小腸と遠位側小腸場所) で腸間膜のリンパ節が細菌感染牛 (ただし感染の成牛ではなく)¹³の時折回復のサイトをすることができます。レプトスピラ症 (レプトスピラ sp.): 乳腺¹⁴リンパ節で細菌の慢性持続性が観察されています。ウシ結核菌: 細菌は牛、子牛¹⁵縦隔や気管気管支リンパ節から回復した後実験感染をされています。さらに、リンパ節の RNA はウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス²のように大きな動物宿主反応を調べるため利用されています。図 2は、牛の体のこれらの主要なリンパ節のサブセットの場所を示しています。

図 2:漫画で描いた内の選択したリンパ節の場所オオツノウシ. リンパ節の番号が付きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

本稿および関連のビデオ、大型動物感染症のトランスクリプトーム研究に関与する分子生物学者のために有益であること、RNA 研究の大きな動物リンパ節の隔離のためのプロトコルを提案する.まず、我々 はリンパ節の例として牛、バイソンの組織からのサンプリングを使用して分離のプロシージャの概要を示します。ビデオに表示されるのこのデモでは、ペアになって、RNA の隔離のための再現可能な組織採取のワークフローです。次に、我々 は安全性、一貫性、および RNA の品質重視で、感染したリンパ節の処理のための重要な考慮事項をについて説明します。

酸性フェノール グアニジン イソチオ シアン酸性試薬による組織からの RNA の準備は、元 Chomczynski とサッキ^16,17の存在下でのシリカ系スピン列浄化法に基づいてください。カオトロ Vogelstein、ガレスピーの¹⁸の原作に基づきます。トランスクリプトミクスの代替方式と保存牛リンパ節からのリカバリーの可能性も検討します。最後に、私たちは安楽死とバイソンから回復された RNA プロファイルのサンプリング時間の増加の影響を描いた代表的な実験を含む大規模な動物の魚で RNA の品質の時間変数の影響を探索し、牛のリンパ節。この記事は分子生物トランスクリプトーム研究を開始また、獣医学の研究にだけ役に立つでしょう。