איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

ניתוח ה-RNA-רצף של transcriptome של בלוטות הלימפה מספק את ההזדמנות כדי לאפיין את התגובה החיסונית של חיות למגוון של פתוגנים. אמנם יש כבר מנוצל מתודולוגיה זו בהרחבה בעכברים, ניתוח הרחבת לאחרונה לתוך יונקים גדולים^1,2. משק חי/גדולים בעלי חיים בלוטות הלימפה יכול לשמש כדי לאפיין תגובות המארח, זיהום, לא רק לשימוש שלהם חיסון או רגישות גנטית מחקרים, לצורך זיהוי מטרות עבור פיתוח התרופה, אלא גם דגם מערכות עבור מחקרים בבני אדם על מחלות שפוגעות. לדוגמה, במקרה של ברוצלוזיס (מחלה חיידקית שפוגעות כי ההשפעות חצי מיליון אנשים ברחבי העולם בכל שנה), למרות גדל באופן משמעותי בעלויות, לימודי כבשים או עיזים שהן יותר רלוונטיות הדבקת בני אדם, החיסון האנושית פיתוח מודלים חיות מעבדה. העכבר זיהום מודלים מסכם את הדברים הזיהום מערכת reticuloendothelial אבל לא את הסימנים הקליניים האופייניים³_.

בניסויים בבעלי חיים גדולים לעומת מעבדה מחקרים שנעשו בבעלי חיים, התהליך של רקמות קציר בהכרח כרוך עיכוב ארוך יותר בין המתת החסד ואת האוסף רקמות, אשר מהווה אתגר פוטנציאל לשימור RNA באיכות גבוהה. RNA תקין חיוני לדור של נתונים transcriptomic רלוונטי מבחינה ביולוגית. הדור של RNA באיכות גבוהה של דגימות רקמה קריטי במיוחד ללימודי הפתוגן בעלי חיים גדולים מתבצע תוך מתקני כליאה. מחקרים כאלה הם מטבעם יותר קשה לבצע כפי שהם דורשים אישרה מתקנים, מאומנים כוח אדם אלא גם לשאת משמעותי בעלות הכספית, אשר, בהתאם לעבודה, יכול לנוע בין עשרות למאות אלפי דולרים. סוגי מחקרים אלה כרוכים גם שיתוף פעולה בין-תחומית והידע רב-תחומי להשלמת שלהם, הוספת את המורכבות שלהם. לכן, הדרכה, התפתחות, ואת הדבקות מערכת יעילה של המדגם אוסף שימור מספק יתרונות משמעותיים במחקרים מולקולריים במורד הזרם של רקמות של חיות נגועות.

האוסף של בלוטות הלימפה גדול מציג אתגרים נוספים עבור אוסף רקמה לעומת דגימה דומה מאתר בלוטות הלימפה. ההכנה הכריתה מדגם מחייבת הבנה בסיסית של האנטומיה של הצומת לימפה, לרבות המבנים הפנימיים הרלוונטיים. המבנה של הלימפה מורכבת של האוניות הלימפה מוקף הסינוסים מלא הלימפה. מבנים אלה מוקפים בתוך כמוסה קשה, סיביים. ⁴ lobule הלימפה “אנטומי פונקציונלי היחידה הבסיסית של הצומת לימפה”, מורכב זקיקי, יחידת עמוק בקליפת המוח, ואת מיתרי מדולרי הסינוסים⁴ (איור 1 א’). B ו- T לימפוציטים הם ביתו זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח, בהתאמה. מבנים אלה מספקים לפיגום תלת-ממד, להקל על האינטראקציה בין לימפוציטים וגם אנטיגן או אנטיגן הצגת תאים.

רווחתה, זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח ניתן לזהות במשטח לחתוך כפי שהם מכילים meshwork רשתי צפופה מופיעים יותר הסינוסים, המורכב מעובדים meshwork רשתי עדין יותר ואשר נראה בהיר יותר כהה (איור 1B). לפי המוסכמות, פתולוגים להפנות האזורים של בלוטות הלימפה כמו קליפת שטחית (זקיקים), את paracortex (יחידות עמוק בקליפת המוח) לשד (מיתרי מדולרי, הסינוסים). בדיקה נכונה של כל שלושה אזורים שסברו הטובה ביותר תרגול בהנחיות שגרתית פתולוגיים הלימפה⁵. שימו לב כי יש וריאציה ניכר עקביות, גודל וצבע של בלוטות הלימפה, אפילו בתוך חיים בודד. כמו בעלי חיים גיל, בלוטות הלימפה שלהם נוטים להקטין את גודל להיות מוצק יותר מאלה של חיים צעירים, בדרך כלל עקב גידול רקמות החיבור שלהם וירידה רגיל הלימפה מבנה^6,7.

איור 1. אנטומיה של הצומת לימפה. (א) תמונה קריקטורה זו מראה את האנטומיה של הצומת לימפה, המתארים מבנים מרכזיים. (B) תמונה זו עדיין מציגה לימפה שור חותכים חתך הרוחב. המבנים/השכבות הרלוונטיות הגלויים לעין מודגשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בהתאם השאלה ניסיוני, הלימפה שונים יהיה עניין עבור איסוף וניתוח. בלוטות הלימפה ההיקפית הם אלה נמצא עמוק בתוך הרקמה התת עורית. הבקר, בלוטות הלימפה היקפי או שטחי משמש לעתים קרובות באימון קליניים וניסויים לכלול הפרוטיד, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural), שטחי במפשעה (supramammary אצל נקבות, האשכים אצל זכרים) ( איור 2). טבלה 1, מאפייני מפתח בלוטות הלימפה שטחית, כמתואר ב- במערכת ‘ בקר ‘⁸, מתוארים. להלן, כמה תוכניות אוסף הצומת לימפה פוטנציאל למחלות זיהומיות חיידקים של הבקר מוצגים כנקודת התחלה עבור החקירה.

Melitensis abortus/Brucella brucella: תקן necropsies עבור abortus דרב-נגוע בקר ו melitensis דרב-עזים נגוע במרכז הלאומי חיה המחלה לשחזר supramammary, prescapular, רקמות parotid בלוטת לימפה , הן של שיוף שהספירה חיידקי ועל ההכנה RNA פרופיל ביטוי מארח ה-RNA. Abortus דרב ניתן לשחזר באופן קבוע בכל אחד מאותם בלוטות הלימפה בקר נגוע השפעול⁹_. הנוכחות של חיידקים בכל אחד מסוגי הלימפה ניתן להבחין ב- melitensisבנגוע עזים עד לפחות תשעה חודשים לאחר הפגיעה באמצעות למתודולוגיות מבוססי ה-RNA ממחקרים שלנו (Boggiatto. et al., לא פורסם). סלמונלה sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), ואת בלוטות לימפה mesenteric היו שימושיים במהלך יצירת פרופילים של פגרי הבקר סלמונלה השכיחות^10,11,12 , יהיה עניין פוטנציאלי ללימודי transcriptomic. E. coli O157:H7: בלוטות לימפה mesenteric (-המעי הדק האמצעית והמיקומים המעי הדק הדיסטלי) יכול להיות האתרים של שחזור של פה ושם של חיידקים עגלים הנגוע (אך לא נגוע הבקר מבוגרים)¹³. לפטוספירוזיס (Leptospira sp.): התמדה כרונית של החיידקים נצפתה בקשרי הלימפה ניקוז בלוטת חלב¹⁴. Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס : בבקר, החיידק כבר התאושש זיהום שלאחר ניסיוני של בלוטות הלימפה mediastinal, tracheobronchial של עגלים¹⁵. בנוסף, הצומת לימפה RNA יש כבר מנוצל כדי לבחון תגובות לארח בעלי חיים גדולים וירוסים, כגון וירוס חזירי תסמונת הרבייה, מערכת הנשימה². איור 2 מציג את המיקום של קבוצת משנה של אלה הלימפה העיקרי בגוף הבקר.

איור 2: קריקטורה המתארים במיקומים שנבחרו הלימפה בבית השחי הצומת פרות, המטופחות . בלוטות הלימפה ממוספרת הם מבואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נייר זה ווידאו משויך, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של גדול הלימפה חיה ללימודים RNA, תוכנן להיות אינפורמטיבי עבור פיצחו המעורבים במחקרים transcriptomic של זיהומים בעלי חיים גדולים. ראשית, אנו מספקים סקירה של ההליך בידוד בלוטות הלימפה, באמצעות דגימת רקמות שור, ביזון כדוגמאות. מזווג עם ההדגמה, כפי שהוא מוצג בסרט, הוא זרימת עבודה עבור דגימה רקמה לשחזור לבידוד RNA. בשלב הבא, אנו מתארים שיקולים חשובים עיבוד של הצומת לימפה נגועות, עם דגש על בטיחות, עקביות ואיכות RNA.

הכנת RNA מתוך הרקמה עם ריאגנט isothiocyanate פנול acidified-guanidine מבוסס על השיטה המקורית של Chomczynski וסאקי^16,17, בטהרה על-מבוססות-סיליקה ספין עמודות רכוש סוכני chaotropic בהתבסס על העבודה המקורית של Vogelstein ו גילספי¹⁸. אנו בוחנים גם את הפוטנציאל ההתאוששות של RNA עבור transcriptomics מן הבקר הלימפה שנשמרו על-ידי שיטות אלטרנטיביות. לבסוף, אנו חוקרים את ההשפעה של המשתנה פעם על איכות ה-RNA ב necropsies בעלי חיים גדולים, כולל ניסוי נציג המתארים את ההשפעה של עלייה זמן בין המתת החסד הדגימה על הפרופיל RNA התאושש מן ביזון, . בלוטות לימפה שור מאמר זה יהיה מועיל לא רק פיצחו אלא גם ל וטרינרי חוקרים מתחיל transcriptomic מחקרים.