İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için
Summary
Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.
Abstract
Hepatosit benzeri hücreler (HLCs) insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) ayırt etmek hepatik metabolizma doğuştan hataları incelemek için yeni fırsatlar sağlar. Ancak, karaciğer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir küçük moleküller tanımlaması destekleyen bir platform sağlamak için yordamı bileşikler binlerce eleme ile uyumlu bir kültür biçimi gerektirir. Burada, 96-iyi doku kültürü plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs tekrarlanabilir farklılaşma izin tamamen tanımlanmış kültür koşulları bir iletişim kuralı’nı açıklar. Ayrıca, Apolipoprotein B (APOB) düşürmek için yeteneklerini için ekran bileşikler platforma kullanarak örnek bir ailesel hiperkolesterolemi hastanın oluşturulan IPSC kaynaklı tetkikine üretilen sağlamaktayız. İlaç keşif ile uyumlu olan bir platform kullanılabilirliğini araştırmacılar roman karaciğeri etkileyen hastalıklar therapeutics tanımlamak izin vermelidir.
Introduction
Tarama için kullanılabilir deneyleri gelişimi başarı nadir bir hastalık hedeflemek için kullanılan ilaçlar belirlenmesinde esas alır. Hipotez veya hedef tabanlı ekranlar (ters farmakoloji) yararlıdır, ancak hastalığın moleküler temeli detaylı bir anlayış gerektirir. Fenotipik ekranlar (klasik farmakoloji) biyokimyasal yollar ayrıntılı bir anlayış gerekir ama bunun yerine doğru hastalığın patofizyolojisi ayna modelleri geliştirilmesi üzerinde güveniyor. Hedef tabanlı yaklaşımlar için coşku rağmen fenotipik ekranları daha başarılı1olmuştur FDA onaylı ilk sınıfındaki ilaç analizleri ortaya koyuyor. Bu yöntem genel amacı bu eleme yüksek üretilen iş için bir platform kurmak için metabolik karaciğer hastalığının tedavisi için küçük moleküller tanımlamak için kullanılabilir. Birkaç vitro modelleri birincil tetkikine, hepatoma hücreleri ve karaciğer progenitör hücre2gibi tarif edilmiştir. Ancak, bu modellerin çoğu kısıtlamalar bulunmaktadır ve doğru bir şekilde kültür metabolik karaciğer eksiklikleri Patofizyoloji özetlemek yeni modeller için bir ihtiyaç. Son zamanlarda, insan pluripotent kök hücreler gen düzenleme ile kombine-si olmak teklif etmek bile nadir hastalıklar kültür ezelî belgili tanımlık lüzum erişim hastalara en nadide modellemek için bir fırsat doğrudan3. Hasta özel iPSCs kullanımı sırasında nadir karaciğer hastalıklarının tedavisi için küçük moleküller keşfetmek için bir araç kavramsal olarak makul olduğu gibi sadece bu yaklaşım4fizibilite gösteren birkaç rapor ediliyor. Ancak, son zamanlarda IPSC kaynaklı tetkikine başarıyla karaciğer metabolizması5eksiklikleri tedavisi için güvenilemez uyuşturucu tanımlamak için kullanılan bir platform kurduk.
Bu iletişim kuralı 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs ayırt ve küçük moleküller içeren bir kitaplık ekranı için onları kullanarak işlemi açıklar. Ayrıca hiperkolesterolemi metabolik karaciğer hastalığı örnek olarak kullanarak bitiş noktası analizi açıklar. Bu yaklaşım rolünü ve uygulama bağlamında bulaşıcı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı, ilaç toksisitesi ve diğer karaciğer bozuklukları, küçük moleküllerin çalışma yararlı olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli bir protein aktivitesini etkileyen nerede küçük moleküller tanımlanır temel hedef ilaç bulma, birçok varolan tarama çalışmalarının odak noktası olmuştur. Bu yaklaşım çok sayıda ilaç, ekranlar üzerinde ters bir fenotip, klasik Farmakoloji, dayalı sağlamıştır, ancak klinik olarak etkili1olmuştur ilk sınıfındaki bileşikler belirlenmesinde daha başarılı olmuştur. Bir dezavantajı fenotipik ilaç keşif için uygun hastalık modelleri kullanılabilirliğine da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55743, DK087377, DK102716 ve HG006398 S.A.D için) tarafından desteklenmiştir. Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop ve Ran Jing katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
