Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga
Summary
Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell’affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell’epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.
Abstract
La possibilità di differenziare le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) in epatociti-come le cellule (HLCs) offre nuove opportunità per studiare gli errori innati di metabolismo epatico. Tuttavia, per fornire una piattaforma che supporta l’identificazione di piccole molecole che potenzialmente può essere utilizzato per trattare la malattia del fegato, la procedura richiede un formato di impostazioni cultura che è compatibile con migliaia di composti di screening. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando condizioni di cultura completamente definita, che consentono la differenziazione riproducibile delle iPSCs umane dell’epatocita-come le cellule in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Forniamo anche un esempio di utilizzo della piattaforma ai composti di schermo per la loro capacità di abbassare l’apolipoproteina B (APOB) prodotta dagli epatociti iPSC-derivato generati da un paziente di ipercolesterolemia familiare. La disponibilità di una piattaforma che è compatibile con la scoperta della droga dovrebbe consentire ai ricercatori di identificare approcci terapeutici per le malattie che colpiscono il fegato.
Introduction
Successo nell’identificazione di farmaci che possono essere utilizzati per indirizzare una malattia rara si basa sullo sviluppo di analisi che può essere utilizzato per lo screening. Ipotesi o schermi basati su destinazione (inversa farmacologia) sono utili, ma richiedono una dettagliata comprensione delle basi molecolari della malattia. Fenotipici schermi (farmacologia classica) evitano la necessità di una comprensione dettagliata delle vie biochimiche, ma invece si basano sullo sviluppo di modelli che rispecchiano esattamente la patofisiologia della malattia. Nonostante l’entusiasmo per gli approcci basati su target, analisi delle droghe first-in-class approvato dalla FDA rivelano che schermi fenotipici sono state molto più successo1. L’obiettivo generale di questo metodo è di stabilire una piattaforma per high throughput screening che può essere utilizzato per identificare piccole molecole per il trattamento della malattia epatica metabolica. Diversi modelli in vitro sono stati descritti compreso epatociti primari, cellule del tumore epatico e di cellule progenitrici del fegato2. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli hanno dei limiti, e c’è bisogno di nuovi modelli che possono ricapitolare con precisione la patofisiologia delle carenze metaboliche del fegato nella cultura. Recentemente, le cellule staminali pluripotenti umane combinate con gene editing hanno offerto l’opportunità di modellare anche il più raro di malattie rare in cultura senza la necessità di accesso pazienti direttamente3. Mentre l’uso di paziente-specific iPSCs come uno strumento per scoprire piccole molecole per il trattamento delle malattie del fegato è concettualmente ragionevole, ci sono soltanto alcuni rapporti che dimostrano la fattibilità di questo approccio4. Tuttavia, recentemente abbiamo stabilito una piattaforma che utilizzato epatociti iPSC-derivati per identificare con successo farmaci che possono essere riproposto per il trattamento delle carenze nel metabolismo del fegato5.
Questo protocollo viene illustrato il processo di differenziazione umana iPSCs dell’epatocita-come le cellule in piastre da 96 pozzetti e il loro utilizzo per lo screening di una libreria di piccole molecole. Viene inoltre descritto l’analisi dell’endpoint utilizzando ipercolesterolemia come un esempio di malattia epatica metabolica. Questo approccio dovrebbe essere utile per studiare il ruolo e l’applicazione di piccole molecole nel contesto della malattia infettiva del fegato, malattia epatica metabolica, tossicità dei farmaci e altri disturbi del fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obiettivo basata scoperta di nuovi farmaci, dove vengono identificate piccole molecole che influenzano l’attività di una proteina specifica, è stato al centro di molti sforzi di selezione esistente. Anche se questo approccio ha fornito numerosi prodotti farmaceutici, schermi basati sull’inversione di un fenotipo, la farmacologia classica, hanno avuto più successo nell’individuazione di composti di first-in-class che sono stati clinicamente efficace1. Uno svantaggio di scoperta della droga fenot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 a Sad). Vorremmo ringraziare il Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Ran Jing per i loro contributi.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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