À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery
Summary
Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.
Abstract
La capacité de différencier les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) en cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) offre de nouvelles possibilités pour l’étude des erreurs innées du métabolisme hépatique. Toutefois, afin de fournir une plate-forme qui prend en charge l’identification de petites molécules qui peut potentiellement être utilisé pour traiter les maladies du foie, cette procédure nécessite un format de culture qui est compatible avec des milliers de composés de dépistage. Nous décrivons ici un protocole utilisant des conditions de culture entièrement définie, qui permettent la différenciation reproductible de CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits vitroplants. Nous fournissons également un exemple d’utilisation de la plateforme aux composés d’écran pour leur capacité d’abaisser l’apolipoprotéine B (APOB) produite à partir des hépatocytes iPSC dérivés produits d’un patient de l’hypercholestérolémie. La disponibilité d’une plate-forme qui est compatible avec la découverte de médicaments devrait permettre aux chercheurs d’identifier de nouveaux traitements pour les maladies qui affectent le foie.
Introduction
Succès dans l’identification des médicaments qui peuvent servir à cibler une maladie rare se fonde sur le développement de tests qui peut être utilisé pour le dépistage. Hypothèse ou écrans axée sur la cible (pharmacologie inverse) sont utiles, mais nécessitent une compréhension détaillée de la base moléculaire de la maladie. Les écrans phénotypiques (pharmacologie classique) éviter la nécessité d’une compréhension détaillée des voies biochimiques, mais reposent plutôt sur l’élaboration de modèles qui reflètent avec précision la physiopathologie de la maladie. Malgré l’enthousiasme pour les approches axées sur la cible, des médicaments de première catégorie approuvés par la FDA, les analyses révèlent que phénotypiques écrans ont été beaucoup plus de succès1. L’objectif général de cette méthode est d’établir une plateforme de criblage à haute qui peut être utilisé pour identifier de petites molécules pour le traitement d’une maladie métabolique du foie. Plusieurs modèles in vitro ont été décrits, notamment des hépatocytes primaires et cellules d’hépatome de cellules progénitrices du foie2. Cependant, la plupart de ces modèles ont des limites, et on a besoin de nouveaux modèles peuvent récapituler avec précision la physiopathologie des déficiences métaboliques de foie dans la culture. Récemment, les cellules souches pluripotentes humaines combinées avec l’édition de gène ont offert une occasion de modèle même les plus rares de maladies rares en culture sans la nécessité d’accès patients directement3. Tandis que l’utilisation du CISP spécifique au patient comme un outil à la découverte de petites molécules pour le traitement des maladies hépatiques rares est raisonnable sur le plan conceptuel, il y a seulement quelques rapports démontrant la faisabilité de cette approche4. Cependant, nous avons récemment établi une plateforme dérivés iPSC hépatocytes permettant d’identifier avec succès des médicaments qui peuvent être réutilisés pour le traitement des déficiences dans le métabolisme du foie5.
Ce protocole explique le processus de différenciation CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits et en les utilisant pour cribler une banque de petites molécules. Il décrit également l’analyse de point de terminaison utilisant hypercholestérolémie comme un exemple d’une maladie métabolique du foie. Cette approche devrait être utile pour étudier le rôle et l’application de petites molécules dans le cadre d’une maladie infectieuse du foie, hépatopathie métabolique, toxicité des médicaments et autres troubles du foie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Découverte de médicaments cible basé, où les petites molécules sont identifiées qui influent sur l’activité d’une protéine spécifique, a fait l’objet de nombreux efforts de dépistage existants. Bien que cette approche a fourni de nombreux produits pharmaceutiques, écrans, basés sur l’inversion d’un phénotype, la pharmacologie classique, ont eu plus de succès dans l’identification des composés de première catégorie qui ont été cliniquement efficace1. Un inconvénient …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 et HG006398 de Sad). Nous tenons à remercier le Dr Behshad Pournasr, Dr. James Heslop et Ran Jing pour leurs contributions.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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