Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking
Summary
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.
Abstract
De mogelijkheid om te differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in hepatocyte-achtige cellen (HLCs) biedt nieuwe kansen om te studeren van aangeboren fouten in hepatische metabolisme. Echter, om een platform die ondersteuning biedt voor de identificatie van kleine molecules die potentieel kunnen worden gebruikt voor de behandeling van de leverziekte, de procedure vereist een cultuur-indeling die compatibel is met de screening van duizenden verbindingen. Hier beschrijven we de volledig gedefinieerde kweekomstandigheden, waarmee reproduceerbare differentiatie van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in de weefselkweek 96-wells-platen die gebruikmaakt van een protocol. We bieden ook een voorbeeld van het gebruik van het platform scherm verbindingen voor hun vermogen tot lagere apolipoproteïne B (APOB) geproduceerd van iPSC afkomstige hepatocyten gegenereerd op basis van een familiale hypercholesterolemie patiënt. De beschikbaarheid van een platform dat compatibel is met drugontdekking mag onderzoekers te identificeren van nieuwe therapieën voor ziekten die invloed hebben op de lever.
Introduction
Succes bij het identificeren van de drugs die kunnen worden gebruikt voor het richten van een zeldzame ziekte is afhankelijk van de ontwikkeling van tests die kunnen worden gebruikt voor de screening. Hypothese of doel gebaseerde schermen (omgekeerde Farmacologie) zijn nuttig, maar vereisen een gedetailleerd inzicht in de moleculaire basis van de ziekte. Fenotypische schermen (klassieke Farmacologie) voorkomen naar de nood voor een gedetailleerd begrip van biochemische pathways, maar in plaats daarvan vertrouwen op de ontwikkeling van modellen die een nauwkeurige afspiegeling van de pathofysiologie van de ziekte. Ondanks het enthousiasme voor doel-gebaseerde benaderingen onthullen analyses van het FDA keurt first-in-class drugs dat fenotypische schermen veel succesvoller1 zijn. Het algemene doel van deze methode is om een platform voor hoge throughput screening die kan worden gebruikt voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van metabole leverziekte. Verscheidene in vitro modellen zijn beschreven inclusief primaire hepatocyten, hepatoma cellen en lever voorlopercellen cellen2. Echter de meeste van deze modellen hebben beperkingen, en er is behoefte aan nieuwe modellen die nauwkeurig de pathofysiologie van metabole lever tekortkomingen in cultuur kan herhalen. Onlangs, menselijke pluripotente stamcellen gecombineerd met gen bewerken kunnen model zelfs de zeldzaamste van zeldzame ziekten in cultuur zonder de noodzaak om patiënten toegang hebben aangeboden direct3. Terwijl het gebruik van patiënt-specifieke iPSCs als een instrument om te ontdekken van de kleine moleculen voor de behandeling van zeldzame lever ziekten conceptueel redelijk wordt, zijn er alleen een paar verslagen aantonen van de haalbaarheid van deze aanpak4. Echter hebben we onlangs een platform waarmee iPSC afkomstige hepatocyten succesvol identificeren drugs die andere doelen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van tekortkomingen in de lever metabolisme5opgericht.
Dit protocol legt het proces van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in 96-wells-platen te differentiëren en ze te gebruiken om het scherm van een bibliotheek van kleine moleculen. Hierin wordt ook de eindpunt-analyse met behulp van hypercholesterolemie als een voorbeeld van stofwisselingsziekte van de lever. Deze aanpak moet nuttig zijn te onderzoeken van de rol en de toepassing van kleine moleculen in het kader van besmettelijke leverziekte, stofwisselingsziekte van de lever, drug toxiciteit en andere leveraandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doel gebaseerd drugontdekking, waar kleine moleculen worden geïdentificeerd die invloed hebben op de activiteit van een specifieke proteïne, is de focus van vele bestaande screening inspanningen. Hoewel deze benadering heeft verstrekt talrijke geneesmiddelen, schermen op basis van het omkeren van een fenotype, klassieke farmacologie, meer succesvol geweest in het identificeren van first-in-class-verbindingen die klinisch doeltreffend1 zijn. Een nadeel van fenotypische drugontdekking is dat het a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 en HG006398 naar S.A.D). Wij wil Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop en Ran Jing bedanken voor hun bijdragen.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
