Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana
Summary
Se describe un protocolo para la detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana mediante la Unión del receptor de la clasificación, sortilina, para el primer bucle luminal de la proteína del transportador de glucosa, GLUT4, como ejemplo.
Abstract
Nuestra capacidad para explorar las interacciones proteína-proteína es la clave para entender las conexiones reguladoras en la célula. Sin embargo, la detección de interacciones proteína-proteína en muchos casos se asocia con importantes desafíos experimentales. En particular, clasificación de los receptores interactúan con su carga de proteínas en el lumen de los compartimentos de membrana a menudo en una manera sensible al detergente, haciendo inservible la co-inmunoprecipitación de estas proteínas. Vinculantes de la ordenación del receptor sortilina al transportador de glucosa que GLUT4 puede servir como un ejemplo de interacciones débiles luminales entre proteínas de la membrana. Aquí, describimos un análisis rápido, sencillo y barato para validar la interacción entre sortilina y GLUT4. Para ello, hemos diseñado y sintetizado químicamente el péptido myc-con la etiqueta correspondiente para el epitopo sortilina Unión potencial en la parte luminal del GLUT4. Sortilina etiquetada con seis histidinas fue expresado en células de mamífero y aislada de lysates de la célula usando granos de cobalto. Sortilina inmovilizado en las cuentas se incubó con la solución del péptido a valores de pH diferentes, y se analizó el material eluído por borrar occidental. Este ensayo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras interacciones de proteínas sensibles al detergente.
Introduction
GLUT4 es una proteína del transportador de glucosa que se expresa predominantemente en células del músculo esquelético y grasa donde interviene el efecto de la insulina en sangre post-prandial glucosa despacho1. Una proteína muy estable, GLUT4 es regulada a nivel poste-de translación. En ausencia de insulina, GLUT4 se excluye en gran parte de la membrana del plasma (por lo tanto, baja permeabilidad basal de glucosa) y se localiza principalmente dentro de la célula en vesículas pequeñas de insulina-responsivo (IRVs) y red trans-Golgi (TGN) que probablemente representan el compartimiento de donantes IRV. Administración de insulina, el IRVs se fusionan con la membrana plasmática y entregan GLUT4 en el sitio de su funcionamiento. Esto aumenta la permeabilidad de la membrana plasmática de la glucosa, por lo la absorción de glucosa de la sangre en adipocitos y miocitos esqueléticos eleva 10 a 40-fold. Tras la retirada de la insulina, GLUT4 se internalizan en endosomas tempranos, clasificación y luego a TGN donde el IRVs son re-formados. Clasificación de ambos pasos en el camino de GLUT4, es decir, recuperación de los endosomas tempranos periférica perinuclear TGN y la formación de las IRVs en el donante TGN membranas están habilitadas por el miembro de la familia Vps10p, sortilina, que representa un tipo I proteína de transmembrana y un receptor de la clasificación. Según un modelo, sortilina funciona como una proteína transmembrana: ATA GLUT4 en el lumen de endosomas y TGN y recluta retrómero o clatrina adaptadores en el lado citoplasmático de la membrana de donantes vía el C-terminal2, 3. Esto facilita la distribución de GLUT4 en portadores vesiculares que translocan GLUT4 entre compartimientos intracelulares.
La interacción de la cola citoplásmica de sortilina retrómero y varias proteínas ha sido bien documentada. Sin embargo, la Unión de la sortilina GLUT4 (y varios de sus otros ligandos de la proteína) ha estado desafiando a probar. En particular, los intentos sortilina co-immunoprecipitate y GLUT4 no han tenido éxito probablemente debido a la naturaleza sensible al detergente de la interacción entre estas dos proteínas. Además, como una proteína de transporte típico, GLUT4 tiene 12 dominios transmembrana y 6 lazos luminales cualquier combinación que potencialmente puede representar un sitio sortilina-obligatorio. Al mismo tiempo, un cuerpo grande de evidencia indirecta, como la colocalización substancial en la célula, Cross-linking con DSP permeable a la membrana y la interacción en el sistema híbrido dos de levadura sugieren eso sortilina puede enlazar a GLUT4. Además, usando este último enfoque en combinacion con la alanina exploración mutagénesis, nos hemos determinado previamente que el dominio de Vps10p de sortilina se une principalmente a la primera lazada luminal de GLUT4. Sin embargo, la prueba de tal interacción en células de mamífero ha sido falta. Aquí hemos aislado sortilina su etiquetado de células transfected 3T3-L1 usando resina de cobalto y demostró que puede interactuar con el péptido síntesis química correspondientes al primer lazo luminal del GLUT4 a pH 6 y pH 8 que se asemejan a medio ácido en el endosomal luz y ambiente neutro en el lumen de las membranas TGN. Ningún enlace de péptido fue detectado en los experimentos de control donde extracto preparado a partir de las células transfectadas no fue cargado en las cuentas del mismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilina es un receptor evolutivo conservado multi-ligando proteína que participa en ambas señales en la membrana plasmática y en intracelular clasificación eventos6,7. Sin embargo, la búsqueda de ligandos de sortilina auténtico (algunas de las cuales son proteínas de la membrana luminal o integral) es complicada como la interacción de sortilina con algunos de sus socios de la Unión parece ser sensible a los detergentes. Por lo tanto, una fácil y forma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación DK52057 y DK107498 de los NIH para K.V.K. X.P fue apoyado por la 2T32DK007201 de grant de formación institucional de los NIH.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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