Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

GLUT4 — это белок транспортера глюкозы, которая выражается главным образом в жира и скелетных мышечных клеток, где он опосредует влияние инсулина на пост натощак крови глюкозы Распродажа¹. Будучи очень стабильного белка, GLUT4 регулируется на столб-поступательные уровне. В отсутствие инсулина, GLUT4 значительной степени исключены из плазматической мембраны (отсюда низкая базальная проницаемость для глюкозы) и локализуется преимущественно внутри клетки в небольших инсулин отзывчивым везикулы (IRVs) и транс Гольджи сети (TGN), которая может представлять IRV доноров отсек. После инсулина администрации IRVs предохранитель с плазматической мембраны и доставить GLUT4 на сайт своего функционирования. Это увеличивает проницаемость мембраны плазмы для глюкозы, так что поглощение глюкозы из крови в адипоциты и скелетные миоциты возрастает с 10 до 40. После ухода инсулина GLUT4 включены в начале/сортировка endosomes и затем извлечь TGN, где IRVs вновь сформированных. Оба сортировки шаги в GLUT4 путь, т.е. извлечение из периферийных раннего endosomes для perinuclear TGN и формирование IRVs на доноров TGN мембраны включены членов семьи Vps10p, sortilin, который представляет тип I трансмембранный белок и сортировки рецептора. По словам одной модели, sortilin работает как белка трансмембранного эшафот: он связывает GLUT4 в просвете endosomes и TGN и нанимает адаптеров retromer или Клатрин цитоплазматических сторону доноров мембраны через его C-конечная^{2, 3}. Это облегчает распространение GLUT4 в везикулярного перевозчиков, которые перемещают GLUT4 между внутриклеточным отсеков.

Взаимодействие цитоплазматических хвост sortilin с retromer и различных адаптер белков хорошо задокументировано. Однако связывание sortilin GLUT4 (и некоторые из его других лигандов белка) было сложно доказать. В частности попытки co-immunoprecipitate sortilin и GLUT4 не были успешно вероятно из-за моющих средств чувствительных характер взаимодействия между этими двумя белков. Кроме того, как типичный транспортер белок GLUT4 имеет 12 трансмембранных доменов и просветный 6 петель любое сочетание которых потенциально могут представлять sortilin привязки сайта. В то же время большой объем косвенных доказательств, например значительное совместное локализации в ячейке, сшивки с проницаемой мембраны DSP, а также взаимодействие в дрожжей два гибридной системы показывают, что sortilin можно привязать к GLUT4. Кроме того используя последний подход в сочетании с аланина, сканирование мутагенеза, мы ранее определили, что домен Vps10p sortilin связывается главным образом первый Люминал петля GLUT4. Однако доказательства такого взаимодействия в mammalian клетках был пропавших без вести. Здесь, мы выделили его меткой sortilin из transfected 3T3-L1 клеток с использованием кобальта смолы и продемонстрировал, что он может взаимодействовать с химически синтезированных пептидов, соответствующий первой Люминал цикла GLUT4 на pH 6 и рН 8, напоминающие кислой среды в от англ люмен и нейтральной среде в просвете TGN мембран. Привязка не пептид был обнаружен в управления экспериментов, где экстракт, приготовленный из не transfected клеток был загружен на же бисер.