Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l’effetto dell’insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione¹. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all’interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, il IRVs si fondono con la membrana plasmatica e consegnare GLUT4 al sito del suo funzionamento. Questo aumenta la permeabilità della membrana del plasma per il glucosio, in modo che l’assorbimento di glucosio dal sangue in adipociti e miociti scheletrici aumenta 10 a 40 volte. Dopo il ritiro di insulina, GLUT4 è interiorizzato in endosomi precoce/ordinamento e quindi estratto a TGN dove il IRVs sono ri-formata. Sia l’ordinamento passi nel pathway di GLUT4, cioè recupero dall’endosomi precoce periferici ad perinucleare TGN e la formazione del IRVs sul donatore TGN membrane sono abilitate per il membro della famiglia Vps10p, sortilina, che rappresenta un tipo la proteina del transmembrane e un recettore ordinamento. Secondo un modello, sortilina funziona come una proteina transmembrana impalcatura: si lega GLUT4 in lumen del endosomi e TGN e reclute retromer o clatrina adattatori al lato citoplasmico del donatore membrana tramite suo C-terminus^{2, 3}. questo facilita la distribuzione di GLUT4 in vettori vescicolari che traslocano GLUT4 tra compartimenti intracellulari.

L’interazione della coda citoplasmatica di sortilina con retromer e varie proteine adattatrici è stata ben documentata. Tuttavia, l’associazione di sortilina per GLUT4 (e molti dei suoi altri ligandi di proteina) è stato impegnativo per dimostrare. In particolare, i tentativi di co-immunoprecipitate sortilina e GLUT4 non hanno avuto successo probabilmente a causa della natura sensibile detergente dell’interazione tra queste due proteine. Inoltre, come una proteina di trasporto tipico, GLUT4 ha 12 domini transmembrane e 6 anelli di luminal qualsiasi combinazione di cui potenzialmente può rappresentare un luogo sortilina-legante. Allo stesso tempo, un grande corpo di prova indiretta, ad esempio la sostanziale co-localizzazione nella cella, cross-linking con membrana permeabile DSP e l’interazione in due sistema ibrido del lievito suggeriscono che sortilina può associare a GLUT4. Inoltre, utilizzando l’approccio di quest’ultimo in combinazione con l’alanina scansione mutagenesi, precedentemente abbiamo determinato che il dominio di Vps10p di sortilina lega principalmente per il primo ciclo di luminal di GLUT4. Tuttavia, la prova di tale interazione in cellule di mammifero è scomparso. Qui, abbiamo isolato sortilina His-tag da cellule trasfettate 3T3-L1 con la resina cobalto e ha dimostrato che può interagire con peptide sintetizzato chimicamente corrispondente per il primo ciclo di luminal di GLUT4 pH 6 e pH 8 simile milieu acide nella endosomal lumen e ambiente neutro nel lume delle membrane TGN. Nessuna associazione di peptide è stata rilevata in esperimenti di controllo cui estratto preparato da cellule trasfettate con non è stato caricato sui branelli stessi.