Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine mit Bindung des Sortier-Rezeptors, Sortilin, um die erste luminalen Schleife von der Glukose-Transporter-Protein, GLUT4, als Beispiel.
Abstract
Unsere Fähigkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erforschen ist der Schlüssel zum Verständnis der rechtlicher Verbindungen in der Zelle. Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in vielen Fällen ist jedoch mit erheblichen experimentelle Herausforderungen verbunden. Insbesondere interagieren Sortierung Rezeptoren mit ihrer Ladung Eiweiß in das Lumen der Membran Fächer oft in ein Waschmittel-Sensitive-Mode, so dass co-Immunopräzipitation dieser Proteine unbrauchbar. Bindung von der Sortierung Rezeptor Sortilin, Glukose-Transporter GLUT4 als Beispiel für schwache luminalen Wechselwirkungen zwischen Membranproteine dienen kann. Hier beschreiben wir einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Assay um die Interaktion zwischen Sortilin und GLUT4 zu überprüfen. Dafür haben wir entworfen und chemisch synthetisiert die Myc-markierte Peptid entspricht der potenziellen Sortilin-Bindung-Epitop in der luminalen Teil des GLUT4. Sortilin mit dem Stichwort sechs Histidin war in Säugerzellen ausgedrückt und isoliert von Zelle Lysates mit Kobalt Perlen. Sortilin an den Perlen immobilisiert wurde die Peptid-Lösung bei verschiedenen pH-Werten inkubiert und der eluierten Material wurde durch Western Blot analysiert. Dieser Test kann leicht an andere Waschmittel-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen sein.
Introduction
GLUT4 ist ein Glukose-Transporter-Protein, das vorwiegend in Fett und skelettartigen Muskelzellen exprimiert ist wo es die Wirkung des Insulins auf postprandialen Blut Glukose Abstand1vermittelt. Ein sehr stabiles Protein ist, GLUT4 auf ein post-translationalen Ebene geregelt. In Abwesenheit von Insulin GLUT4 wird weitgehend von der Plasmamembran (daher niedrige basale Durchlässigkeit für Glukose) ausgeschlossen und wird vor allem innerhalb der Zelle in kleinen Insulin eine geschlechtergerechte Vesikeln (IRVs) lokalisiert und Trans-Golgi-Netzwerk (TGN), die voraussichtlich vertreten sind IRV-Spender-Fach. Bei der Insulinverabreichung die IRVs verschmelzen mit der Plasmamembran und liefern GLUT4 an die Seite seines Funktionierens. Dies erhöht die Durchlässigkeit der Plasmamembran für Glucose, so dass Glukoseaufnahme aus Blut in Adipozyten und Skelett Myozyten 10 bis 40-fold steigt. Nach dem Rückzug Insulin ist GLUT4 in frühen/Sortierung Endosomen verinnerlicht und dann abgerufen, TGN wo die IRVs neu formiert werden. Beide sortieren Schritte in den GLUT4 Weg, d.h. Entnahme von peripheren frühen Endosomen bis Perinukleäre TGN und die Bildung der IRVs auf der TGN-Spender, die Membranen von Vps10p Familienmitglied, Sortilin, aktiviert sind, die einen Typ darstellt ich transmembranen Protein und Sortier-Rezeptor. Nach einem Modell Sortilin arbeitet als ein transmembranen Gerüst-Protein: es bindet GLUT4 in das Lumen der Endosomen und TGN und Rekruten Retromer oder Clathrin-Adapter auf der cytoplasmatischen Seite der Spender Membran über dem C-Terminus2, 3. Dies erleichtert die Verteilung von GLUT4 in vesikuläre Träger, die GLUT4 zwischen intrazellulären Kompartimenten translozieren.
Das Zusammenspiel der cytoplasmatischen Schwanz des Sortilin mit Retromer und verschiedene Adapter-Proteine ist gut dokumentiert. Jedoch ist die Bindung des Sortilin GLUT4 (und einige seiner anderen Protein-Liganden) eine Herausforderung gewesen um zu beweisen. Insbesondere sind Versuche, co-Immunoprecipitate Sortilin und GLUT4 nicht wahrscheinlich aufgrund der Waschmittel-Sensitive Art der Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen erfolgreich gewesen. Darüber hinaus als eine typische Transporter-Protein hat GLUT4 12 transmembranen Domänen und 6 luminalen Loops beliebige, die Kombination davon möglicherweise eine Sortilin-Bindungsstelle darstellen kann. Zur gleichen Zeit die ein großer Körper der indirekten Beweis, wie die erheblichen Co Lokalisierung in der Zelle, Vernetzung mit Membran durchlässig DSP und der Interaktion in Hefe-zwei-Hybrid-System empfehlen, dass Sortilin GLUT4 gebunden werden kann. Darüber hinaus haben mit den letzteren Ansatz in Kombination mit der Alanin Scannen Mutagenese, wir zuvor festgestellt, dass die Vps10p-Domäne des Sortilin in erster Linie an die erste luminalen Schleife von GLUT4 bindet. Allerdings hat der Beweis für solch eine Interaktion in Säugetierzellen gefehlt. Hier haben wir isoliert sein-tagged Sortilin von 3 t 3-L1 transfizierten Zellen mit Kobalt Harz und gezeigt, dass es chemisch synthetisierten Peptid entspricht der ersten luminalen Schleife des GLUT4 bei pH 6 und pH 8 interagieren kann, die im sauren Milieu ähneln die Endosomal Lumen und neutralen Umgebung in das Lumen der TGN-Membranen. Keine Peptid-Bindung wurde in Experimente nachgewiesen dem Extrakt aus nicht transfizierten Zellen vorbereitet auf den gleichen Perlen geladen wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin ist ein evolutionär konservierte Multi-Liganden-Protein-Rezeptor, der bei beiden Signalisierung an der Plasmamembran und in intrazellulären Sortierung Veranstaltungen6,7beteiligt ist. Die Suche nach dem authentischen Sortilin Liganden (einige davon sind luminalen oder integraler Membranproteine) ist jedoch komplizierter, wie das Zusammenspiel von Sortilin mit einigen seiner Bindungspartner zu empfindlich auf Waschmittel zu sein scheint. Daher eine einf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Forschungsstipendien, die DK52057 und DK107498 von der NIH, K.V.K. X.P wurde unterstützt durch die institutionelle Ausbildung Grant 2T32DK007201 vom NIH unterstützt.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
