Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

GLUT4 is een glucose transporter proteïne die overwegend wordt uitgedrukt in vet en skeletale spiercellen, waar het het effect van de insuline op postprandiale bloed glucose goedkeuring¹bemiddelt. Wordt een zeer stabiele eiwitten, is GLUT4 op een posttranslationele niveau geregeld. Bij gebrek aan insuline, GLUT4 is grotendeels uitgesloten uit het plasma-membraan (vandaar lage basale permeabiliteit voor glucose) en is gelokaliseerd vooral binnen de cel in kleine insuline-responsieve blaasjes (IRVs) en trans-Golgi network (TGN) die dreigt te vertegenwoordigen de IRV donor compartiment. Op insuline toediening, de IRVs zekering met het plasma-membraan en GLUT4 leveren op de site van de werking ervan. Dit verhoogt de permeabiliteit van het plasma-membraan voor glucose, zodat dat glucose-opname uit bloed in adipocytes en skeletale myocytes 10 tot 40-fold stijgt. Na de terugtrekking van de insuline, is GLUT4 geïnternaliseerd in vroege/sorteren Endosomen en vervolgens opgehaald voor TGN waar de IRVs zich opnieuw gevormd. Beide sorteren stappen in het GLUT4 traject, d.w.z. wegnemen uit de perifere vroege Endosomen tot het perinuclear TGN, en de vorming van de IRVs op de TGN donor membranen zijn ingeschakeld door een familielid van Vps10p, sortilin, die een type vertegenwoordigt I transmembraan eiwit en een sorteer receptor. Volgens één model, sortilin werkt als een transmembraan steiger eiwit: het GLUT4 in het lumen van de Endosomen en TGN bindt, en werft adapters van de retromer of clathrin naar de cytoplasmatische kant van de donor membraan via haar C-terminus^{2, 3}. Dit vergemakkelijkt de verdeling van de GLUT4 in vesiculaire dragers die GLUT4 tussen de intracellulaire compartimenten translocate.

De interactie van de cytoplasmatische staart van sortilin met retromer en verschillende adaptor eiwitten is goed gedocumenteerd. Echter, de binding van sortilin naar GLUT4 (en op een aantal van haar andere proteïne liganden) heeft zijn uitdagend om te bewijzen. In het bijzonder, pogingen om te co-immunoprecipitate sortilin en GLUT4 niet gelukt waarschijnlijk te wijten aan het wasmiddel-gevoelige aard van de interactie tussen deze twee eiwitten. Bovendien, als een typische transporter proteïne, heeft GLUT4 12 transmembraan domeinen en 6 luminal loops elke mogelijke combinatie van die potentieel een sortilin-bindende site vertegenwoordigen kan. Op hetzelfde moment, een grote hoeveelheid indirect bewijs, zoals aanzienlijke co lokalisatie in de cel, dwarsbinding met membraan-permeabele DSP, en de interactie in gist twee hybridesysteem suggereren dat sortilin kan binden aan de GLUT4. Bovendien hebben gebruikt de laatste benadering in een combinatie met de alanine scannen mutagenese, wij eerder vastgesteld dat het domein van de Vps10p van sortilin voornamelijk aan de eerste luminal lus van GLUT4 bindt. Echter, het bewijs van een dergelijke interactie in zoogdiercellen heeft ontbroken. Hier hebben we geïsoleerd zijn-gelabeld sortilin uit cellen transfected 3T3-L1 met behulp van kobalt hars en aangetoond dat kan communiceren met chemisch gesynthetiseerde peptide overeenkomt met de eerste luminal lus van GLUT4 bij pH 6 en pH 8 die lijken op zure milieu in de endosomal lumen en neutrale omgeving in het lumen van de TGN membranen. Geen bindend peptide werd ontdekt in controle experimenten waar uittreksel bereid uit niet-transfected cellen was geladen op de dezelfde parels.