كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء
Summary
يصف لنا بروتوكول للكشف عن المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء استخدام ربط لمستقبلات الفرز، سورتيلين، إلى حلقة لومينال الأولى من البروتين الناقل الجلوكوز، GLUT4، على سبيل مثال.
Abstract
أن قدرتنا على استكشاف تفاعلات البروتين البروتين هو المفتاح لفهم الاتصالات التنظيمية في الخلية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في كثير من الحالات يرتبط مع تحديات تجريبية كبيرة. على وجه الخصوص، الفرز مستقبلات تتفاعل مع حمولتها البروتين في التجويف المقصورات الغشاء غالباً بطريقة حساسة للمنظفات، مما يجعل co-إيمونوبريسيبيتيشن من هذه البروتينات غير قابلة للاستخدام. ملزمة من سورتيلين مستقبلات الفرز لنقل الجلوكوز GLUT4 قد تخدم كمثال على ضعف تفاعلات البروتينات الغشاء لومينال. وهنا يصف لنا مقايسة سريعة وبسيطة وغير مكلفة للتحقق من صحة التفاعل بين سورتيلين و GLUT4. لذلك، قمنا بتصميم وتصنيعه كيميائيا الببتيد معلم حركة المقابلة حانمه ملزمة سورتيلين المحتملة في الجزء لومينال من GLUT4. سورتيلين المفتاحية هيستيدينيس ست المعرب عنها في خلايا الثدييات، ومعزولة عن ليساتيس الخلية باستخدام قشور حبات. سورتيلين المعطل تداولها على الخرز كان المحتضنة مع الحل الببتيد في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة، وكان تحليل المواد الوتيد بواسطة النشاف الغربية. هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تفاعلات أخرى حساسة للمنظفات البروتين-بروتين.
Introduction
هو GLUT4 بروتين الناقل جلوكوز التي يعبر عنها غالباً في خلايا العضلات والدهون والهيكل العظمى حيث أنه يتوسط تأثير الأنسولين على إزالة جلوكوز الدم بعد prandial1. يجري بروتين مستقرة جداً، وينظم GLUT4 عند مستوى بوستترانسلاشونال. نظراً لغياب الأنسولين، GLUT4 مستبعد إلى حد كبير من غشاء البلازما (ومن ثم انخفاض نفاذية القاعدية الجلوكوز) وهو مترجم أساسا داخل الخلية في حويصلات تستجيب للأنسولين الصغيرة (إيرفس) وشبكة ترانس-غولجي (TGN) التي من المحتمل أن تمثل حجرة المانحة ايرف. لدى الإدارة الأنسولين، إيرفس الصمامات مع غشاء البلازما وتسليم GLUT4 إلى موقع عمله. وهذا يزيد من نفاذية غشاء البلازما للسكر، حيث أن امتصاص الجلوكوز من الدم في adipocytes والهيكل العظمى myocytes يرتفع 10 إلى ضعفا. بعد سحب الأنسولين، مستوعبة في اندوسوميس المبكر/الفرز GLUT4 واستعادتها ثم إلى TGN حيث إيرفس إعادة تشكيل. فرز كل الخطوات في المسار GLUT4 واسترجاع أي من اندوسوميس المبكر الطرفية إلى بيرينوكلير TGN وتشكيل إيرفس على الجهة المانحة TGN الأغشية هي تمكين أفراد الأسرة Vps10p، سورتيلين، الذي يمثل نوع أنا بروتين ترانسميمبراني ومستقبل فرز. ووفقا لنموذج واحد، يعمل سورتيلين بروتين سقالة transmembrane: يربط GLUT4 في التجويف اندوسوميس و TGN، والمجندين محولات ريترومير أو كلاثرين إلى جانب هيولى المانحين الغشاء عن طريق المحطة ج2، 3-وهذا يسهل توزيع GLUT4 إلى الناقلين حويصلية ترانسلوكاتي GLUT4 بين الأقسام داخل الخلايا.
التفاعل بين هيولى ذيل سورتيلين مع ريترومير ومختلف البروتينات محول توثيقاً جيدا. ومع ذلك، قد تم تحدي ربط سورتيلين إلى GLUT4 (والعديد من أن يغاندس البروتين الأخرى) لإثبات. على وجه الخصوص، محاولات لشركة إيمونوبريسيبيتاتي سورتيلين و GLUT4 لم تنجح ربما بسبب طبيعة التفاعل بين هذه البروتينات هما المراعية للمنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، بروتين الناقل نموذجي، قد GLUT4 مجالات transmembrane 12 و 6 حلقات لومينال أية تركيبة من التي يحتمل أن تكون قد تمثل موقع سورتيلين-ملزمة. في الوقت نفسه، تقترح مجموعة كبيرة من الأدلة غير المباشرة، مثل كبير التعريب المشارك في الخلية، العابرة للربط مع نفاذية الغشاء حزب اليسار الديمقراطي، والتفاعل في نظام هجين اثنين الخميرة يمكن ربط هذا سورتيلين إلى GLUT4. وعلاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج الأخير في تركيبة مع ألانين مسح الطفرات، سابقا قررنا أن المجال Vps10p من سورتيلين بربط أساسا الحلقة الأولى لومينال من GLUT4. بيد أن الدليل على مثل هذا التفاعل في خلايا الثدييات كان مفقوداً. هنا، نحن قد عزلت سورتيلين صاحب معلم من الخلايا transfected 3T3-L1 استخدام الراتنج الكوبالت، وأثبتت أنها يمكن أن تتفاعل مع الببتيد مركباً كيميائيا المقابلة للحلقة الأولى لومينال من GLUT4 على درجة الحموضة 6 ودرجة الحموضة 8 التي تشبه الوسط الحمضي في اندوسومال التجويف وبيئة محايدة في التجويف الأغشية TGN. تم الكشف عن لا ربط الببتيد في تجارب التحكم حيث تم تحميل استخراج إعداد من الخلايا غير ترانسفيكتيد على نفس الخرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
سورتيلين هو مستقبلات بروتين يجند متعدد مصانة تطورية التي تشارك في كل إشارة في غشاء البلازما وفي داخل الخلية فرز الأحداث6،7. ومع ذلك، البحث عن يغاندس في سورتيلين أصيلة (بعضها من البروتينات الغشاء لومينال أو لا يتجزأ) معقد كما يظهر تفاعل سورتيلين مع بعض شركائه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المنح البحثية وأيده DK52057 و DK107498 من المعاهد الوطنية للصحة إلى K.V.K. X.P 2T32DK007201 منحة التدريب المؤسسي من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
