JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Abstract

Kovalent DNA adducts kimyasallar tarafından kurulan veya uyuşturucu kanserojen etki gücü ile kanserojen işlemleri başlatma aşamasında en önemli faktörlerden biri değerlendirilecektir. Tumorigenesis nedeni olarak kabul edilir, bu kovalent bağlama şimdi kimyasal karsinojenezis merkezi bir dogma olarak değerlendirilir. Burada, sitokrom P450 tarafından katalize reaksiyonlar istihdam yöntemleri açıklanmıştır ve ek Biyotransformasyon enzimler kimyasal madde veya ilaç metabolitleri bu DNA şekillendirme için onların harekete geçirmek için potens araştırmak için adducts. Hücresel kesirler Biyotransformasyon enzimler (mikrozomal ve sitozolik örnekleri ile cytochromes P450 ya da diğer Biyotransformasyon enzimler, Yani, peroxidases, NADPH: sitokrom P450 sahip yalıtım açıklayan yordamlar sunulmaktadır oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase veya ksantin oksidaz). Ayrıca, yöntem açıklanmıştır kullanılabilir analiz kimyasallar metabolik aktivasyonu için bu enzimler DNA izolasyonu için hem de. Ayrıca, algılama ve kimya/ilaç-elde edilen DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri adducts, Yani, 32P postlabeling tekniğinin farklı değişiklikler ve radyoaktif etiketli istihdam kimyasal analiz, vardır ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Introduction

Xenobiotics (çevresel kimyasallar veya ilaçlar) metabolizma iki aşama1‘ oluşur. Evre ı ve II amacı başlangıçta hidrofobik (suda çözünen) bileşikleri daha hidrofilik işlemek için (suda çözünen), böylece bunları kolayca yolu ile idrar, dışkı ya da ter excretable yapma. Aşama ı (functionalization) reaksiyonları içerir oksidasyon, Redüksiyon, ve prokollajen katalize enzimler tarafından sitokrom P450s gibi (P450s, CYPs), peroxidases (i.e., Siklooksijenaz, COX), aldo-keto redüktaz (AKRs) ve mikrozomal monooxygenases (FMOs) flavin içeren. Ayrıca çeşitli redüktaz Yani, mikrozomal NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitozolik NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), ksantin oksidaz (XO) ve aldehit oksidaz (AO)1 tarafından aracılı indirgeme reaksiyonu içerir faz . İkinci aşama (fiil), aşamasında bağlanmıştır Fonksiyonel grupların ben polarizasyonu daha da artırmak için küçük polar moleküller eşlenik için kullanılır. Faz II dahil sulfotransferases (SULTs), N, O– acetyltransferases (NAT), methyltransferases Katekol –O– Metiltransferaz (COMT), glutatyon Sgibi tepki katılmak için kabul enzim örnekleri- Transferazlar (GSTs) ve üridin nükleotittir glucuronosyltransferases (UGTs)1. Enzimler aşamasında sınıflandırılması ı ya da II olduğunu, ancak, değil katı ve bazı enzimler tartışmasız her iki kategoride gruplandırılabilir.

P450 enzimleri (AK 1.14.14.1) proteinler mevcut birçok kimyasallar, onların dönüşüm3,4katalizlerler Biyotransformasyon katılmak çeşitli organizmalarda içeren heme vardır. Oksijen ikinci atom formu su ile iki elektron [denklemi (1 gerektirir tepki azalır iken nerede dioxygen bir atom xenobiotics, molekül giriliyor bir tepki ile birçok yüzeylerde prokollajen P450 enzimleri katalizler )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Memeli hücreleri (mikrozomal P450 sistemleri) endoplazmik retikulum membran lokalize P450 enzimleri daha fazla NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitokrom b5 içeren multienzyme monooxygenase sistem üyesi olan , NADH: sitokrom b5 alfa redüktaz enzim substrat olarak adlandırdığı. Genel kabul gören bir teori çelişkisiz P450 için gerekli iki elektron verici NADPH/POR sistemidir. Yine de, sitokrom b5 elektron bir donör P450 için yani olarak ikinci azalma, tepki döngüsü sırasında P450 azaltarak elektron bir donör NADH: sitokrom b5 ile birlikte hareket nereye hareket redüktaz2,3,4.

Memeliler çeşitli P450 enzimleri kullanmak (Örneğin, aileler 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 ve 27 enzimler) gibi steroid, değerli endojen bileşiklerin sentezi için ve doğal ürünler2,3 katabolizma için kullanabilirsiniz . Diğer CYP memeli enzimler, gibi insan CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ve 3A4, metabolize eksojen kimyasallar, ilaç olarak kullanılır. 5 , 6 ilaçların metabolizması katalizlerler en önemli 3A alt familya, özellikle CYP3A4 CYPs enzimlerdir. Xenobiotics pro-kanserojen ve pro-toxicants, gibi dönüşümleri insan CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 ve 3A42,5tarafından aracılık. Bu CYPs çoğu karaciğer (hariç, CYP1A1 ve 1B1) mevcut. Yine de, CYPs de birkaç extrahepatic organlarda ifade edilir. Böyle P450s büyük önemi, ağırlıklı olarak olabilir katıldığınız zaman onlar bioactivation kimyasallar (ilaçlar) metabolizmasında bu organları7reaktif ara ürün için. Bu durumda mutlaka olmamasına rağmen çeşitli P450s onların yüzeylerde vardır çeşitli bileşikler tarafından indüklenir.

Birçok P450 enzimleri kimyasal (ilaç) toksisite bir rol oynamaktadır. Onlar sadece onların detoksifikasyon metabolitleri xenobiotics dönüştürmek ama aynı zamanda onları Ayrıca genellikle onların toksisite neden farklı biyolojik özellikleri sergilemek endojen oluştururlar değiştirmek reaktif türler için harekete geçirmek. DNA, yağlar ve proteinler onların değişikliğe göre reaktif electrophiles ve aktif kimyasallardan üretilen radikaller için hedef olabilir. DNA söz konusu olduğunda, birkaç önemli gen yanıt ve mekanizmaları çözme zaten bilinen2,3,4,5.

Değişiklikler DNA hücre büyüme denetim azalmasına neden olabilir ve bu fenomen kanserojen süreçleri gelişimine lider baskın faktör olarak kabul edilir. Kimyasallar ile kovalent DNA nesil adducts kanserojen etki gücüne sahip kanserojen başlatma aşamasında en önemli adımlardan biri8,9,10,11işler gibi karar. Bu gösterilmiştir DNA oluşumu arasındaki ilişkileri adducts ve tumorigenesis oluşan, DNA miktarında azalma adducts ise chemoprevention8,9,10için, sorumludur 11 , 12 , 13 , 14. kanserojen/uyuşturucu-türetilmiş oluşumu DNA adducts DNA bireysel üsleri üzerinde bağlıdır ve bu üslerin DNA dizileri tarafından etkilenir. DNA onarım adducts kendi konumunda (kopya etmek veya sigara transkripsiyonu DNA dizisi) ve değiştirilmiş nükleotit dizileri8,11,12,15, türleri üzerinde bağlıdır 16.

Bu makalede, biz DNA değiştirilmiş metabolitleri aktif olması için onların potens araştırmak için (ilaçlar) kimyasal enzim katalize dönüştürme kullanan yordamlarda açıklanır (DNA üreten adducts). Kovalent DNA bağlama için genellikle test bileşik olmalıdır bağlı olarak bireysel uyuşturucu oksidatif veya indirgeyici reaksiyonlar tarafından aktive. Oksidatif veya indirgeyici harekete geçirmek test edilmiş kimyasal bir P450 bağımlı enzim sistemi mikrozomal hücre altı kesir mevcut tarafından aracılık ettiği ya da azaltma redüktaz ile tarafından microsomes (POR, NADH: sitokrom b5 hem de mevcut redüktaz, P450 enzimleri) ve hücresel sitozolik hücre altı fraksiyonları (NQO1, XO, AO, peroksidaz). Reaktif metabolitleri bundan sonra bağlamak DNA’yı oluşturan DNA adducts. İndirgeyici ve oksidatif reaksiyonlar Bu reaktif tür çeşitli ilaçlara etkinleştirmek önemli olduğundan, yükseltgeme-indirgeme enzimatik sistemi istihdam deneysel yordamlar açıklanmıştır. Ayrıca, adducts algılama ve bu DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Test kimyasal enzim sistemleri tarafından aktif olup olmadığını belirlemek için iki bağımsız yordam DNA’ya bağlı tavsiye edilir: 32P postlabeling tekniği ve radyoaktif etiketli kullanarak bileşik (e.g., 3H ya da 14 C). İlk pilot, 32P postlabeling tahlil eleme önerilir. DNA içeriği tam olarak değerlendirilir, çözümlerinde belirlenmesi her iki yöntem önce gelmesi gerekir.

Radyoaktif olmayan kimyasallar (kanserojen/ilaç) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-radyoaktif fosfor (32P) ile ek fosforilasyon tarafından değiştirilmiş DNA’ın enzimatik hidroliz 32P postlabeling tekniği kullanır OH pozisyon ve kimyasal-deoxynucleotide ayrılması adducts normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides Kromatografi17 tarafından (şekil 1). Kimyasal bileşik tarafından değiştirilmiş DNA tarafından endonükleaz, micrococcal nükleaz ve dalak fosfodiesteraz bilinen eksonükleaz aktivitesi, hidrolize. Hem normal (değiştirilmemiş) içeren ve 3´-monophosphates [γ –32P] ATP pH 9,5 formu 5´- için taşıyıcı (radyoaktif olmayan) ATP ve T4-polinükleotit kinaz huzurunda ile tepki deoxyribonucleoside değiştiren hidrolize DNA karışımı 32P etiketli 3´, 5´-bisphosphates ( şekil 1‘ deki “Standart” bir prosedür). Kullanılan alkali pH deoxyribonucleoside 3´-monophosphates konumu 3´, dephosphorylate T4-polinükleotit kinaz enzim aktivitesinin en aza indirerek yeteneğine sahiptir. Ayrılık ve çözünürlük 32P olarak etiketlenmiş üzerinden adducts kimyasallar tarafından değiştirilmiyor etiketli deoxynucleotides gerçekleştirilir tarafından çok yönlü anyon-Satım ince tabaka Kromatografi (TLC) polyethyleneimine (PEI) Selüloz (Resim 2 ). (Yönde, D1 ve D2) birinci ve ikinci elüsyon adım etiketli normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides yanı sıra [32P] fosfat başlar, elektrolit kısa bir parçası üzerine su çözümleri kullanarak TLC-PEI-selüloz plaka eluted Kromatografik kağıt hidrofobik özellikleri (kanserojen/uyuşturucu-adducts) sergilenmesi ilişkili kimyasallar içeren deoxynucleotides Ayrıca çözülmesi için PEI-selüloz plaka başlangıcında korunur, ancak TLC plaka üstüne uygulanan birkaç farklı solvent sistemleri ile D3 ve D4 yönde (Şekil 2). Yerelleştirme adducts gelişmiş ekran autoradiography; kullanılarak yapılır ayrılmış adducts röntgen filmleri karanlık tanınabilir noktalar olarak algılanır. Noktalar alanlarında plaka eksize ve radyoaktivite ölçmek için sıvı mercek veya sayma Cerenkov tarafından kullanılır. Harita ve DNA ölçmek için adapte edilmiş yöntemi Imaging bir depolama fosfor tespit chromatograms adducts tarafından 32P postlabeling tahlil şimdi de kullanılır. 18 anlık görüntüleyici makine sık sık böyle algılaması için kullanılmaktadır ve miktar DNA’ın adducts. Bu yöntem daha autoradiography19ekran tekniği gelişmiş 32P algılamak için daha–dan 10 – kat daha yüksek hassasiyet sağlar.

DNA miktarda adducts göreli değerleri denklem (2) aşağıdaki gibi kullanarak hesaplanan (RAL), etiketleme adduct gibi belirlenir:

BGBM. Buna deoxynucleotides Sigara
RAL =—(2)
32P-ATP belirli aktivite (BGBM. / pmol) x pmol deoxynucleotides

RALs adducted deoxynucleotides sayısı oranları oranı toplam [adducted ve normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides] saymak oranları değerleri deoxynucleotides20,21. Ancak, bu hesaplama eşittir üzerinde temel verimliliği etiketleme adducts ve normal deoxynucleotides22. Çeşitli DNA adducts için klasik (“Standart”) 32P postlabeling tekniği uygun bir uygulamadır (hantal ve/veya hantal adducts), ancak, hassasiyeti tatmin edici değil algılamak için düşük miktarlarda bulunan DNA adducts. Bu yordamı kullanarak, bir adduct 10 değiştirilmemiş7 deoxynucleotides DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) içinde tespit miktarıdır.

Bu klasik 32P postlabeling yordam değişiklikleri çeşitli teknik duyarlılığını yükseltmek için kullanılan. En çok 10-100 kat daha yüksek hassasiyet belirlenmesi, adducts 32P etiketleme elde etti [γ –32P] ATP (yoğunlaşması yordam) sınırlayıcı Düzeyler’i kullanarak. 23 , 24 32P postlabeling yöntemi duyarlılık artışı sindirilir DNA içeren bir kuluçka kullanır sağlayan başka bir yordam nükleaz P1 (dan Penicillium citrinum)21 (şekil 1) ile adducts. Deoxynucleotides ile ilişkili kimyasallar (adducted nukleotid) aslında değil yüzeylerde Bu enzim ise bu enzim değiştirilmemiş deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate tercih ediyor. Bu nedenle, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (örneğin, deoxyribonucleosides) T4-polinükleotit kinaz tarafından [32P] fosfat γ –32P tarafından fosforile değil] ATP. Ancak, bazı kimyasallar nerede nükleotit (adducted deoxynucleotides) bağlı, arylamine adducts gibi deoxyguanosine, can bedephosphorylated Bu enzim tarafından C8, yerine. Buna ek olarak, çoğu diğer adducts (örneğin, adducts N2 deoxyguanosine yerine) nükleaz P1 tarafından dephosphorylated değil. Bu değişiklik 32P postlabeling bu yöntem çok daha hassas, duyarlı üçten fazla büyüklük artan getirir. Ayrıca, 32P postlabeling bu sürümü için bir yöntem sağlar nerede daha yüksek miktarda DNA (5-10 µg) ve taşıyıcı-Alerjik bir fazlalığı [γ – 32P] ATP kullanılan.

Zenginleştirmek için başka bir yöntem adducts, Gupta25tarafından açıklanan, fizikokimyasal kullanır özelliklerinin hantal deoxynucleotide adducts, hangi-ebilmek var olmak hulâsa n-butanol faz transfer Ajan tetrabutylammonium varlığında değiştirilmemiş deoxynucleotides kötü bu organik çözücü tarafından ayıklanır ise [32P] fosfat, etiketleme önce klorür (TBA) (şekil 1). Ancak, daha az hidrofobik adducts, oluşan deoxynucleotides örneği ile aromatik olmayan hantal moieties ya da küçük alkil artıkları, değişiklik için değil etkili çıkarılan nile-butanol. Bu nedenle, onlar ne zaman 32P postlabeling yöntemi bu değişikliğe göre analiz edilir aslında belirlenemeyen vardır.

Hem daha önce bahsedilen sürümleri 32P postlabeling artış duyarlılık ve miktar DNA’ın adducts son derece (üç büyüklük kadar), 109,10 başına normal sigara bir tespit edememek nükleotit (0.3 – 3 Ekrem/µg DNA). Bu iki yöntem kimyasallar kovalent DNA’yı bağlamak onların verimlilik için test etmek için tavsiye edilir ve bu nedenle, bu iş ayrıntılarda açıklanmıştır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve kullanım, laboratuvar Helsinki Bildirgesi ile uyumlu olan hayvanlar (311/1997, Tarım Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti), düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. yalıtım hepatik mikrozomal ve sitozolik kesirler Karaciğer hücre altı fraksiyonları (P450 enzimleri veya cytosols redüktaz veya çözünür peroxidases zengin zengin microsomes) sıçanlarından emir basit fark Santrifüjü (105.000 x g) hazırlayın.N…

Representative Results

Kimyasal maddeler (kanserojen/ilaçlar) potens onların kovalent sonuçlanan ara ürün için metabolize araştırmak için harekete geçirmek enzim katalize (Yani, P450, peroksidaz, redüktaz) kullanımı için burada açıklanan protokolleri kullanarak DNA için bağlama (DNA nesil adducts), antikanser Ajan ellipticine farmakolojik eylem (için bir daha gözden geçirme gördüğünüz gibi29,30,<sup class="x…

Discussion

Bu yazıda, yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji bioactivated kovalent DNA’ın üretimi kaynaklanan metabolik ara ürün için olmak kimyasallar potens eğitim adducts gösterilmiştir. Bu çok önemli bir konudur, çevresel kimyasallar potens veya enzimatik onların harekete geçirmek için kovalent DNA üreten metabolitleri ilaçların değerlendirilmesi adducts çünkü kanser ve tedavisi, geliştirilmesinde önemli bir alandır. DNA’sı değişikliğe göre kanserojen tümör gelişiminin neden kabul şimdi ka…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada çek Bilim Vakfı (GACR, grant 17-12816S) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image