JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

הערכת עוצמת סביבתיים כימיקלים, תרופות, להיות enzymatically bioactivated כדי intermediates יצירת DNA קוולנטיות adducts, הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. שיטות מתוארים עבור הפעלת מתחם לטופס שה-DNA adducts, כמו גם טכניקות שלהם זיהוי, כימות.

Abstract

DNA קוולנטיות adducts שהוקמה על ידי כימיקלים או סמים עם העוצמה מסרטנים נשפטים כאחד הגורמים החשובים ביותר בשלב הייזום של תהליכים מסרטנים. איגוד קוולנטיות זה, הנחשב הגורם tumorigenesis, עכשיו מוערך של הדוגמה המרכזית של carcinogenesis כימי. כאן, שיטות מתוארים העסקת את התגובות על ידי ציטוכרום P450, אנזימים ביואמסה נוספים כדי לחקור את העוצמה של כימיקלים או סמים עבור ההפעלה שלהם כדי מטבוליטים ויוצרים את הדנ א הללו adducts. ההליכים מוצגים המתארים את ניתוקה של שברים הסלולר הפו אנזימים ביואמסה (microsomal cytosolic דגימות עם cytochromes P450 או אחרים ביואמסה אנזימים, קרי, peroxidases, nadph ל: ציטוכרום P450 oxidoreductase, oxidoreductase H:quinone NAD (P) או xanthine אוקסידאז). יתר על כן, מתוארות שיטות זה יכול לשמש עבור ההפעלה מטבולית של כימיקלים שנותחה על ידי אנזימים אלה, כמו גם עבור בידוד של דנ א. עוד יותר, השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות DNA כימית/סמים-נגזר adducts, דהיינו, שינויים שונים של הטכניקה P-postlabeling 32, העסקתם של רדיואקטיבי שכותרתו ניתח כימיקלים, הם מוצגים בפירוט.

Introduction

חילוף החומרים של ואינטראקציות (כימיקלים סביבתיים או תרופות) מתרחשת בשני שלבים1. שלבים I ו- II במטרה להבהיר את תרכובות הידרופוביות במקור (לא מסיסים במים) יותר הידרופילית (מסיסים במים), ובכך הופך אותם excretable בקלות באמצעות שתן, צואה או זיעה. שלב I (functionalization) תגובות כוללים חמצון, הפחתה, ו hydroxylation מזורז על ידי אנזימים כגון ציטוכרום P450s (P450s, CYPs), peroxidases (כלומר., cyclooxygenase, קוקס), אלדו-keto reductases (AKRs), ו microsomal פלווין המכילים monooxygenases (FMOs). שלב אני כולל גם הפחתת תגובות, מתווכת על ידי מגוון רחב של reductases דהיינו microsomal nadph ל: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ו- NAD (P) cytosolic H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthine אוקסידאז (XO) אלדהיד אוקסידאז (AO)1 . בשלב השני (נטיה), קבוצות פונקציונליות שצורפו בשלב אני משמשות נזווג מולקולות קוטביות קטנות כדי להגביר עוד יותר את הקוטביות. דוגמאות של אנזימים נחשב להשתתף התגובה של שלב II כוללים sulfotransferases (ים), N, O– acetyltransferases (Nat), methyltransferases כגון catechol –O– methyltransferase (COMT), גלוטתיון S– transferases (GSTs), uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. הסיווג של אנזימים בשלב I או II עם זאת, לא נוקשה, ולא ניתן לקבץ כמה אנזימים ניתן לטעון גם בקטגוריה.

אנזימי P450 (EC 1.14.14.1) הן heme המכיל חלבונים המצויים אורגניזמים שונים, אשר להשתתף ביואמסה של כימיקלים רבים, ותזרז את ההמרה3,4. אנזימי P450 לעודד hydroxylation של סובסטרטים רבים, עם תגובת איפה אטום אחד של dioxygen מוחדרים המולקולה של ואינטראקציות, בעוד האטום השנייה של חמצן הוא מופחת כדי ליצור מים על ידי התגובה כי דורש שני אלקטרונים [המשוואה (1 3,)]4:

RH + O2 + nadph ל + H+ ← ROH + H2O + NADP+ (1)

אנזימי P450 לוקליזציה. ממברנה רשתית תוך-פלזמית בתרבית של תאים (מערכות P450 microsomal) הם חברי המערכת multienzyme monooxygenase, אשר בהמשך מכיל ניקוטין: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ציטוכרום b5 , המצע של האנזים כינה NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז. תיאוריה מקובלים hypothesizes כי התורם האלקטרונים שני לצורך P450 היא מערכת ניקוטין/בבקשה. בכל זאת, ציטוכרום b5 עשוי לשמש גם כתורם אלקטרונים עבור P450, כלומר תורם של האלקטרון הפחתת P450 במהלך הפחתת השני של מחזור התגובה שלה, שבו היא פועלת יחד עם NADH: ציטוכרום b5 3,2,רדוקטאז4.

יונקים לנצל את אנזימי P450 שונים (למשל, האנזימים של משפחות 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, ו 27) לסינתזה של תרכובות אנדוגני יקרי ערך, כמו סטרואידים, להשתמש בהם עבור קטבוליזם של מוצרים טבעיים2,3 . אחרים CYP בתרבית של האנזימים, כגון CYP1A2 האנושי, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ו 3A4, לעכל אקסוגני כימיקלים המשמשים כמו סמים. 5 , 6 אנזימים החשובים ביותר ותזרז את חילוף החומרים של תרופות הם CYPs של תת משפחה 3A, במיוחד CYP3A4. ההמרות של ואינטראקציות, כגון פרו-מסרטנים ו- pro-חשיפה לרעלים, הן מתווכת על-ידי CYP1A1 האנושי 1A2, 1B1, 2A6, 2E1,2,3A45. רוב CYPs אלה נמצאים הכבד (למעט CYP1A1 ו- 1B1). ובכל זאת, CYPs גם מבוטאים במספר האיברים extrahepatic. P450s כזה יכול להיות משמעות רבה, בעיקר כאשר להשתתף הם בחילוף החומרים bioactivation של כימיקלים (תרופות) intermediates הממוגן ב איברים אלה7. P450s שונים הם המושרה על ידי מספר תרכובות מצעים שלהם, למרות שזה לא בהכרח המקרה.

אנזימי P450 רבים לשחק תפקיד רעילות כימית (סמים). הם יכולים להמיר את ואינטראקציות לא רק מטבוליטים דטוקסיפיקציה שלהם, אך גם להפעיל אותם למינים תגובתי, המשנים את מקרומולקולות אנדוגני, כי בנוסף התערוכה מאפיינים ביולוגיים שונים, בדרך כלל גורם הרעילות שלהם. ה-DNA, שומנים, חלבונים ייתכן המטרות ולשנותן שלהם על-ידי electrophiles תגובתי רדיקלים המופקים כימיקלים מופעל. במקרה של ה-DNA, פתרון מספר גנים חשובים תגובות ומנגנונים שלהם ידועים כבר2,3,4,5.

השינויים ב- DNA עלולה לגרום ירידה בשליטה צמיחת תאים, תופעה זו נחשבת הגורם השולט המובילים להתפתחות של תהליכים מסרטנים. הדור של DNA קוולנטיות adducts עם כימיקלים בעל העוצמה מסרטנים נאמד כמו אחד הצעדים החשובים ביותר בשלב הייזום של מסרטנים מעבד8,9,10,11. הוכח כי היחסים בין היווצרות של דנ א adducts, tumorigenesis להתרחש, ואילו ירידה בכמות הדנ א adducts אחראי chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. היווצרות של גורם מסרטן/סמים-derived DNA adducts תלוי בסיסים בודדים של דנ א, מושפע את רצפי הבסיסים האלה ב- DNA. התיקונים של ה-DNA adducts תלויות שלהם מיקום (על צירוף ד. נ משועתקים או שאינם עיבד) וסוגים של נוקלאוטיד ששונה רצפים8,11,12,15, 16.

במאמר זה נתאר תהליכי ניצול ההמרה מזורז-אנזים של כימיקלים (תרופות) לחקור מחוזקה תופעל לתוך מטבוליטים אשר שינוי ה-DNA (הפקת דנ א adducts). עבור איגוד ה-DNA קוולנטיות, המתחם בדיקה בדרך כלל צריך להיות מופעל גם על-ידי תגובות חמצון או מוטעה, בהתאם סמים בודדים. הפעלת חימצוני או מוטעה של כימיקלים שנבדקו מתווך על ידי מערכת אנזימטיות תלויות-P450 נוכח השבר subcellular microsomal או על ידי הפחתה reductases להציג את שניהם microsomes (POR, NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז, אנזימי P450) והן בחלקים הסלולר cytosolic subcellular (NQO1, הקמב ץ, AO, peroxidase). מטבוליטים תגובתי לאחר מכן לאגד דנ א ויוצרים דנ א adducts. בגלל תגובות חמצון והן חותכות חשוב להפעיל מספר תרופות אלו מינים תגובתי, מתוארים ההליכים ניסיוני העסקת מערכת אנזימטי חמצון/צמצום. יתר על כן, adducts השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות הדנ א הללו מתוארים בפירוט.

שני הליכים עצמאיים כדי לקבוע אם הכימיקל מבחן, מופעל על ידי מערכות אנזימטיות, מאוגד ל- DNA מומלצים: 32P-postlabeling טכניקה של המתחם רדיואקטיבי התווית על-ידי ניצול (למשל., 3H או 14 C). הראשון מומלץ טייס, הקרנת וזמינותו P-postlabeling 32. הקביעה של תוכן ה-DNA פתרונות, להעריך במדויק, חייב להופיע לפני שתי השיטות.

32P-postlabeling טכניקה מנצל את הידרוליזה אנזימטי של דנ א שונה על-ידי כימיקלים לא רדיואקטיבי (מסרטן/סמים) 3´-phosphodeoxynucleosides, זרחון נוספים עם זרחן רדיואקטיבי (32P)-5´- הו גם ההפרדה של כימיקלים-deoxynucleotide adducts מן deoxynucleotides (שלא שונתה) נורמלי מאת כרומטוגרפיה17 (איור 1). דנ א שונה על-ידי תרכובת כימית hydrolyzed לפי תערובת של endonuclease נוקלאז micrococcal, אקסונוקלאז, המכונה phosphodiesterase הטחול. התערובת של הידרוליזה DNA המכיל שני רגיל (יבוצעו בהם שינויים) ולשנות deoxyribonucleoside 3´-monophosphates הוא הגיב עם ATP [γ –32P] בנוכחות המוביל (שאינו רדיואקטיבי) ATP ו- T4-polynucleotide קינאז ב- pH 9.5 על טופס 5´- 32התווית על-ידי P 3´, 5´-bisphosphates (“רגילה” הליך באיור1). ה-pH בסיסי בשימוש הוא מסוגל מזעור פעילות אנזים של T4-polynucleotide קינאז כדי dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates-3´ עמדה. ההפרדה והרזולוציה של 32התווית על-ידי P adducts מן deoxynucleotides שכותרתו ששונו על ידי כימיקלים לא מבוצע על ידי אניון רב-כיווני-המרת שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) על polyethyleneimine (פיי) תאית (איור 2 ). בשלבים • תנאי הראשון והשני (בכיוון D1 ו- D2), שכותרתו deoxynucleotides (שלא שונתה) רגילה, כמו גם [32P] פוספט נמצאים eluted מן ההתחלה של צלחת TLC-פיי-תאית באמצעות פתרונות מים של אלקטרוליט על חתיכת קצר נייר כרומטוגרפי חלה על ראש הלוח TLC, ואילו deoxynucleotides המכיל כימיקלים מאוגד בתערוכה מאפיינים הידרופובי (מסרטן/סמים-adducts) נשמרים בתחילתו של פיי-תאית צלחת בנוסף לפתור עם מספר מערכות הממס שונות בכיוונים D3, D4 (איור 2). לוקליזציה של adducts מתבצעת באמצעות מסך משופרת autoradiography; adducts מופרדים מזוהים כמו כתמים כהים לזיהוי על סרטי צילום רנטגן. האזורים של כתמים טוחנות מהצלחת ומשמשת לכמת רדיואקטיביות על-ידי גזים או Cerenkov לספור. פוספור אחסון הדמיה שיטה כי כבר מותאם כדי למפות ולכמת את הדנ א adducts על chromatograms זוהה על ידי 32P-postlabeling assay גם משמש כיום. 18 Imager מיידית המכונה לעתים קרובות מנוצל לשם איתור כזה, כימות של דנ א adducts. שיטה זו מספקת יותר מ 10 פעמים רגישות גבוהה יותר לגילוי 32P מאשר בטכניקה של מסך משופרת autoradiography19.

כמויות של ה-DNA adducts נחושים כמו ערכים של קרוב משפחה adduct תיוג (RAL), מחושב באמצעות המשוואה (2) כדלקמן:

cpm. adduct deoxynucleotides
RAL =—(2)
פעילות ספציפית של 32P-ATP (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

הערכים של RALs הם היחס של הרוזן שערי adducted deoxynucleotides מעל ספירת המחירים של סכום [adducted ונורמלי (שלא שונתה) deoxynucleotides]20,deoxynucleotides21. עם זאת, חישוב זה מבוסס על שוויון תיוג היעילות של adducts ו- deoxynucleotides נורמלי22. ההליך (“רגילה”) הקלאסית של 32P-postlabeling טכניקה מתאימה עבור דנ א שונים adducts (מגושם ו/או ללא עבים adducts), לעומת זאת, הרגישות אינה מספקת כדי לזהות adducts שנמצאו כמויות נמוכות ב- DNA. באמצעות הליך זה, הסכום של adduct ב- deoxynucleotides 107 יבוצעו בהם שינויים ב- DNA (0.3 fmol adduct/µg ה-DNA) הוא לזיהוי.

מגוון של שינויים של זו הקלאסית 32הליך P-postlabeling כבר נעזרו להעלות את רמת הרגישות של הטכניקה. עד 10-100 פעמים רגישות גבוהה יותר של נחישות של adducts על ידי 32P תיוג הושגה באמצעות הגבלת רמות של ATP [γ –32P] (ההליך התעצמות). 23 , 24 הליך נוסף במתן שעלייה הרגישות של שיטת P-postlabeling 32מנצל של דגירה של מתעכל DNA המכיל adducts עם נוקלאז P1 (מתוך Penicillium citrinum)21 (איור 1). אנזים זה מעדיף dephosphorylate שלא deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, ואילו deoxynucleotides עם כימיקלים מאוגדת (נוקלאוטידים adducted) הם בעצם לא מצעים של אנזים זה. לכן, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (כלומר, deoxyribonucleosides) הם לא phosphorylated על ידי T4-polynucleotide קינאז מאת [32P] פוספט וγ –32P] ATP. עם זאת, חלקם של נוקלאוטידים איפה כימיקלים מאוגדים (adducted deoxynucleotides), כגון arylamine adducts שהוחלפו-C8 של deoxyguanosine, יכול bedephosphorylated על ידי אנזים זה. לעומת זאת, רוב השני adducts (למשל, adducts שהוחלפו ב N2 של deoxyguanosine) הם לא dephosphorylated על ידי נוקלאז P1. שינוי זה של 32P-postlabeling הופך שיטה זו במידה ניכרת רגיש יותר, הגדלת הרגישות שלה על-ידי סדרי גודל יותר משלושה. יתר על כן, גירסה זו של 32P-postlabeling מספק שיטה שבו גבוה יותר כמויות של DNA (5-10 µg) ו עודף של הספק ללא ATP [γ – 32P] יכול להיות מנוצל.

שיטה נוספת להעשיר adducts, שתואר על ידי גופטה25, מנצל את physicochemical מאפייני מגושם deoxynucleotide adducts, אשר ניתן לחלץ לתוך n-butanol בנוכחות שלב העברת הסוכן tetrabutylammonium כלוריד (יפורסם בהמשך) (איור 1) לפני [32P] פוספט תיוג, ואילו deoxynucleotides שלא שונתה מופקים לקוי על ידי הממס האורגני הזה. עם זאת, פחות הידרופוביות adducts, המורכב על דוגמה של deoxynucleotides שונה עם moieties מגושם הלא-ארומטי או אלקיל קטן משקעים, לא ביעילות יחולצו עם n-butanol. לפיכך, הם בעיקרו של דבר בלתי מורגשת כאשר הם נותחו על ידי שינוי זה של 32שיטת P-postlabeling.

שתי הגרסאות כאמור של 32P-postlabeling להגביר הרגישות ואת כימות של ה-DNA adducts מאוד (עד שלושה סדרי גודל), להיות מסוגל לזהות את אחד adduct לכל 109,10 נורמלי נוקלאוטידים (0.3 – 3 (קרית אתא) / µg דנ א). שתי השיטות המומלצות עבור בדיקות הכימיקלים ליעילות שלהם לאגד covalently דנ א, ו, לכן, הם מתוארים בעבודה זו בפרטים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (311/1997, משרד החקלאות, צ’כיה), אשר תואם הצהרת הלסינקי. 1. בידוד של הכבד שברים Microsomal ו- Cytosolic הכן שברים subcellular הכבד (microsomes עשיר אנזימי P450 או cytosols עשיר reductases או peroxidases מסיסים) של חולדות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית…

Representative Results

באמצעות פרוטוקולים המתוארים כאן על הניצול של הפעלת מזורז-אנזים (קרי, P450, peroxidase, רדוקטאז) לחקור את העוצמה של כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) כדי להיות מטבוליזם כדי intermediates וכתוצאה מכך קוולנטיות שלהם איגוד ה-DNA (דור של דנ א adducts), היינו מסוגלים לפתור (i) מנגנון של פעילות פר…

Discussion

בנייר זה, הוכח מתודולוגיה נרחב נגיש ללמוד את העוצמה של כימיקלים להיות bioactivated כדי intermediates מטבולית, וכתוצאה מכך הדור ה-DNA קוולנטיות adducts. זה הוא נושא קריטי, כי הערכה של עוצמת כימיקלים סביבתיים או סמים של הפעלת אנזימטי שלהם כדי מטבוליטים יצירת DNA קוולנטיות adducts הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הצ’כית (GACR, גרנט 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image