Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door ³²P-postlabeling

Het metabolisme van xenobiotica (milieu chemicaliën of drugs) vindt plaats in twee fasen¹. Fasen I en II willen maken van de oorspronkelijk hydrofobe (niet oplosbare) stoffen meer hydrofiele (in water oplosbaar), waardoor ze gemakkelijk excretable zijn via urine, ontlasting of zweet. Fase I (functionalization) Reacties omvatten oxidatie, vermindering, en hydroxylering gekatalyseerd door enzymen zoals cytochroom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (dwz., cyclooxygenase, COX), aldo-keto-reductases (AKRs), en microsomale Flavin-bevattende monooxygenases (FMO). Fase I bevat ook vermindering reacties, gemedieerd door een scala aan reductases dat wil zeggen, microsomale NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytosolische NAD (P) quinone oxidoreductasen (NQO1), xanthine oxidase (XO) en aldehyde oxidase (AO)¹ . In de tweede fase (conjugatie), de functionele groepen die gekoppeld waren in fase zijn ik gewend conjugaat kleine polaire moleculen verder verhogen de polariteit. Voorbeelden van enzymen beschouwd om deel te nemen in de reactie van fase II omvatten sulfotransferases (SULTs), N, O– acetyltransferases (NAT), methyltransferases zoals catechol –O– methyltransferase (COMT), glutathione S– transferasen (GSTs), en uridine difosfaat glucuronosyltransferases (UGTs)¹. De indeling van de enzymen in fase I of II is, echter, niet stijf, en sommige enzymen aantoonbaar kunnen worden gegroepeerd in beide categorieën.

P450 enzymen (EG 1.14.14.1) zijn de Heem met eiwitten aanwezig in verschillende organismen, die deelnemen aan de biotransformatie van veel chemische stoffen, hun conversie^3,4te katalyseren. De P450 enzymen katalyseren hydroxylatie van vele verschillende ondergronden, met een reactie waar één atoom van dioxygen is ingevoerd in de molecule van xenobiotica, terwijl het tweede atoom zuurstof is teruggebracht tot vorm water door de reactie die twee elektronen [de vergelijking (1 vereist )]^3,4:

RH + O₂ NADPH + H⁺ → ROH + H₂O + NADP⁺ (1)

P450 enzymen gelokaliseerd in het membraan van het endoplasmatisch reticulum van zoogdiercellen (microsomale P450-systemen) zijn leden van de multi monooxygenase-systeem, waarin verder NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytochroom b₅ , het substraat voor het enzym genoemd als NADH: cytochroom b₅ reductase. Een algemeen aanvaarde theorie veronderstelt dat de donor van de twee elektronen die nodig zijn voor de P450 het NADPH/POR-systeem is. Niettemin kan cytochroom b₅ ook fungeren als een donor van elektronen voor P450, namelijk als donor van het elektron verminderen van P450 tijdens tweede verlaging van haar reactie-cyclus, waar het fungeert samen met NADH: cytochroom b₅ reductase^2,3,4.

Zoogdieren gebruiken verschillende P450 enzymen (bijvoorbeeld de enzymen van gezinnen 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 en 27) voor de synthese van waardevolle endogene stoffen, zoals steroïden, en ze gebruiken voor katabolisme van natuurproducten^2,3 . De andere CYP zoogdieren enzymen, zoals menselijke CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 en 3A4, metaboliseren exogene chemicaliën die worden gebruikt als geneesmiddel. ^{5 , 6} de belangrijkste enzymen katalyseren metabolisme van drugs zijn CYPs van de onderfamilie 3A, vooral CYP3A4. De conversies van xenobiotica, zoals pro-kankerverwekkende stoffen en pro-toxische stoffen, zijn gemedieerd door menselijke CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 en 3A4^2,5. De meeste van deze CYPs zijn aanwezig in de lever (behalve CYP1A1 en 1B1). De CYPs zijn echter eveneens uitgedrukt in verscheidene extrahepatic organen. Dergelijke P450s zou van grote betekenis, voornamelijk wanneer nemen ze in bioactivation metabolisme van chemische stoffen (drugs) aan reactieve intermediairen in deze organen⁷. Verschillende P450s worden veroorzaakt door de diverse verbindingen die hun substraten, maar dit niet noodzakelijkerwijs het geval is.

Vele P450 enzymen spelen een rol in de (drug) chemische toxiciteit. Zij kunnen de xenobiotica omzetten niet alleen in hun metabolieten van detoxificatie, maar ook activeren hen reactieve soorten, waarvoor wijzigen van endogene macromoleculen die bovendien verschillende biologische eigenschappen, meestal veroorzaakt door hun toxiciteit vertonen. DNA, lipiden en eiwitten mogelijk de doelstellingen voor hun wijziging door reactieve elektrofielen en radicalen gegenereerd op basis van geactiveerde chemicaliën. In het geval van DNA, oplossen van verschillende belangrijke gene reacties en hun mechanismen zijn al bekend^2,3,4,5.

De veranderingen in DNA kunnen resulteren in een afname van de cel groei controle, en dit verschijnsel wordt beschouwd als de overheersende factor die leidt tot de ontwikkeling van kankerverwekkende processen. De generatie van covalente DNA adducten met chemische stoffen die kankerverwekkend vermogen wordt beoordeeld als een van de belangrijkste stappen in de initiatie fase van kankerverwekkende^{8,9,10,11 processen}. Het bleek dat de relaties tussen de vorming van DNA adducten en tumorvorming optreden, terwijl een daling in de hoeveelheid DNA adducten is verantwoordelijk voor chemoprevention^{8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14}. de vorming van kankerverwekkende stof/drug-afgeleid DNA adducten is afhankelijk van individuele basissen van DNA, en wordt beïnvloed door de volgorde van deze basen in DNA. De reparatie van DNA adducten zijn afhankelijk van hun locatie (op de getranscribeerde of niet-getranscribeerd bundel van DNA) en soorten gemodificeerde nucleotide sequences^{8,11,12,15, 16}.

In dit artikel beschrijven we procedures met behulp van het enzym-gekatalyseerde conversie van chemische stoffen (drugs) te onderzoeken hun potentie te worden geactiveerd in metabolieten die gemodificeerd DNA (genereren van DNA adducten). Covalente binding van DNA, de teststof moet meestal worden geactiveerd door oxidatieve of reductieve reacties, afhankelijk van individuele geneesmiddelen. Oxidatieve of reductieve activering van geteste chemische stoffen wordt gemedieerd door een P450-afhankelijke enzymatische systeem aanwezig in de microsomale subcellular fractie of door reductie met reductases presenteren zowel in microsomes (POR, NADH: cytochroom b₅ reductase, P450 enzymen) en cellulaire cytosolische subcellular breuken (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reactieve metabolieten daarna binden aan DNA vorming DNA adducten. Omdat zowel oxiderende en reducerende reacties belangrijk zijn voor het activeren van deze reactieve soorten verschillende drugs, worden de experimentele procedures met de enzymatische oxidatie/verwijderingssysteem beschreven. Bovendien, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van deze DNA adducten in detail worden beschreven.

Twee onafhankelijke procedures om te bepalen of de teststof, geactiveerd door enzymatische systems, is gebonden aan DNA worden aanbevolen: de ³²P-postlabeling techniek en met behulp van radioactief gelabelde stof (bijv., ³H of ¹⁴ C). Voor de eerste wordt piloot, screening van de ³²P-postlabeling bepaling aanbevolen. De bepaling van het DNA-gehalte in oplossingen, juist geëvalueerd, moet voorafgaan aan beide methoden.

De ³²P-postlabeling techniek maakt gebruik van de enzymatische hydrolyse van DNA gewijzigd door niet-radioactieve chemische producten (carcinogeen/drug) 3´-phosphodeoxynucleosides, extra fosforylatie met radioactief fosfor (³²P) bij de 5´- OH adducten positie, en de scheiding van chemische-deoxynucleotide van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides door chromatografie¹⁷ (Figuur 1). DNA gewijzigd door een chemische verbinding is gehydrolyseerd door een mengsel van endonuclease en micrococcal nuclease exonuclease, bekend als fosfodiësterase milt. Het mengsel van gehydrolyseerde DNA dat beide normaal (ongewijzigd) bevat en bewerkt deoxyribonucleoside 3´-monophosphates is gereageerd met [γ –³²P] ATP in het bijzijn van de vervoerder (niet-radioactieve) ATP en T4-polynucleotide kinase bij pH 9,5 naar formulier 5´- ³²P-label 3´, 5´-bisphosphates (“standaard” procedure in Figuur 1). De gebruikte alkalische pH is geschikt voor het minimaliseren van de enzymactiviteit van T4-polynucleotide kinase aan dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates op positie 3´. Scheiding en resolutie van ³²P-geëtiketteerden adducten van gelabelde deoxynucleotides die niet zijn gewijzigd door chemische stoffen wordt uitgevoerd door meerdere richtingen anion-uitwisseling Dunnelaagchromatografie (TLC) op polyethyleneimine (PEI) cellulose (Figuur 2 ). In de eerste en tweede elutie stappen (in de richting van D1 en D2), worden gelabelde normale (ongewijzigde) deoxynucleotides evenals [³²P] fosfaat geëlueerd vanaf het begin van de plaat van de TLC-PEI-gemengd met cellulose met behulp van water oplossingen van elektrolyt op een kort stukje chromatografische papier toegepast op de bovenkant van de TLC-plaat, dat het deoxynucleotides gebonden chemicaliënhoudend exposeren hydrofobe eigenschappen (carcinogeen/drug-adducten) gehandhaafd aan het begin van PEI-gemengd met cellulose plaat blijven worden bovendien opgelost met verschillende oplosmiddel systemen in D3 en D4 richtingen (Figuur 2). Lokalisatie van adducten wordt uitgevoerd met behulp van autoradiografie scherm verbeterd; de gescheiden adducten die worden herkend als donkere herkenbare plekken op X-ray films. De gebieden van spots zijn weggesneden uit de plaat en gebruikt te kwantificeren van de radioactiviteit door vloeibare scintillatietelling of Cerenkov tellen. Een opslag fosfor imaging methode die aangepast is voor kaart en kwantificeren van DNA adducten op chromatogrammen gedetecteerd door de ³²P-postlabeling assay wordt nu ook gebruikt. ¹⁸ the Instant Imager machine wordt vaak gebruikt voor dergelijke detectie en kwantificering van DNA adducten. Deze methode biedt meer dan 10 – keer hogere gevoeligheid voor het opsporen van ³²P dan de techniek van het scherm verbeterd autoradiografie¹⁹.

Hoeveelheid DNA adducten als waarden van relatieve labeling (RAL) adduct, berekend met behulp van de vergelijking (2) als volgt worden bepaald:

CPM. in adduct deoxynucleotides
RAL =—(2)
specifieke activiteit van ³²P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

De waarden van de RAL’s zijn de verhouding tussen de tarieven van de graaf van deoxynucleotides geadduceerd over graaf tarieven van totaal [geadduceerd en normale (ongewijzigde) deoxynucleotides]^2120,deoxynucleotides. Echter, deze berekening is gebaseerd op gelijke etikettering efficiëntie van adducten en normale deoxynucleotides²². De klassieke (“standaard”) procedure van de ³²P-postlabeling techniek is geschikt voor verschillende DNA adducten (omvangrijk en/of niet-omvangrijk adducten), de gevoeligheid is echter niet bevredigend te detecteren adducten gevonden in lage bedragen in DNA. Met deze procedure, is het bedrag van een adduct in 10⁷ ongewijzigd deoxynucleotides in DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) aantoonbaar.

Een aantal wijzigingen van deze klassieke ³²P-postlabeling procedure hebben gebruikt te verheffen van de gevoeligheid van de techniek. Maximaal 10 tot 100 keer hogere gevoeligheid van bepaling van adducten door ³²P-labeling is geboekt met behulp van beperkende niveaus van [γ –³²P] ATP (de intensivering procedure). ^{23 , 24} een verdere procedure die dat een toename van de gevoeligheid van de ³²P-postlabeling-methode maakt gebruik van een incubatie verteerd DNA bevatten adducten met nuclease P1 (van Penicillium citrinum)²¹ (Figuur 1). Dit enzym verkiest te ongewijzigde deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate, overwegende dat de deoxynucleotides met afhankelijke chemicaliën (geadduceerd nucleotiden) in wezen niet de substraten van dit enzym zijn. Daarom gedefosforyleerd deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (d.w.z., deoxyribonucleosides) zijn niet phosphorylated door T4-polynucleotide kinase door [³²P] fosfaat uit γ –³²P] ATP. Echter, sommige van nucleotiden waar chemicaliën zijn gebonden (geadduceerd deoxynucleotides), zoals arylamine adducten vervangen bij C8 van deoxyguanosine, kan bedephosphorylated door dit enzym. In tegenstelling, de meeste andere adducten (b.v.adducten vervangen op N² voor deoxyguanosine) zijn niet gedefosforyleerd door nuclease P1. Deze wijziging van ³²P-postlabeling maakt deze methode aanzienlijk gevoeliger, verhogen van de gevoeligheid van meer dan drie ordes van grootte. Bovendien, deze versie van ³²P-postlabeling biedt een methode waar hogere hoeveelheden DNA (5-10 µg) en een overmaat aan vervoerder-vrije [γ – ³²P] ATP kan worden gebruikt.

Een andere methode te verrijken de adducten, beschreven door Gupta²⁵, maakt gebruik van de fysisch-chemische eigenschappen van de omvangrijke deoxynucleotide adducten, die kan worden gewonnen in n-butanol in aanwezigheid van een fase transfer agent tetrabutylammoniumwaterstofsulfaat chloride (TBA) (Figuur 1) vóór [³²P] fosfaat labeling, overwegende dat ongewijzigde deoxynucleotides slecht worden geëxtraheerd door dit organisch oplosmiddel. Echter, minder hydrofobe adducten, bestaande voor voorbeeld van deoxynucleotides gemodificeerde met niet-aromatische omvangrijk wordt of kleine alkyl residuen, zijn niet effectief gewonnen met n-butanol. Vandaar, zijn zij in wezen niet op te sporen wanneer zijn geanalyseerd door deze wijziging van de ³²P-postlabeling methode.

Zowel de eerder genoemde versie van ³²P-postlabeling verhoging van de gevoeligheid en de kwantificering van DNA adducten enorm (tot drie ordes van grootte), zijnde kundig voor speurder een adduct per 10^9,10 normale nucleotiden (0.3 – 3 amol/µg DNA). Deze twee methoden worden aanbevolen voor het testen van de chemicaliën voor hun efficiëntie covalent binden aan DNA en daarom worden ze beschreven in dit werk in details.