JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات في المختبر وتصميمها من 32فبوستلابيلينج

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

تقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية، والمخدرات، وأن يكون انزيماتيكالي بيواكتيفاتيد إلى وسيطة توليد التساهمية الحمض النووي adducts، ميدان هام في تطوير السرطان ومعالجته. ويرد وصف أساليب للتنشيط المجمع لشكل الحمض النووي adducts، فضلا عن تقنيات للكشف والتحديد الكمي.

Abstract

التساهمية الحمض النووي adducts يتكون من المواد الكيميائية أو العقاقير بفاعلية مسرطنة يحاكمون كواحد من أهم العوامل في مرحلة بدء العمليات المسببة للسرطان. يتم الآن تقييم هذا الربط التساهمي، الذي ينظر في قضية توموريجينيسيس، كعقيدة مركزية التسرطن الكيميائية. هنا، يتم وصف الأساليب استخدام ردود الفعل التي تحفزها السيتوكروم P450، والأنزيمات أحيائي إضافية للتحقيق في فاعلية المواد الكيميائية أو العقاقير لمن التفعيل لنواتج الأيض تشكيل هذه الحمض النووي adducts. وترد الإجراءات تصف عزلة كسور الخلوية تملك الإنزيمات أحيائي (عينات ميكروسومال وسيتوسوليك مع cytochromes P450 أو غيرها أحيائي الإنزيمات، أي، بيروكسيداسيس، نادف: السيتوكروم P450 أوكسيدوريدوكتاز، أوكسيدوريدوكتاز H:quinone NAD (P)، أو زانتيني أوكسيديز). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الأساليب التي يمكن استخدامها لتنشيط التمثيل الغذائي لتحليل المواد الكيميائية هذه الإنزيمات، فضلا عن تلك المتعلقة بعزل الحمض النووي. علاوة على ذلك، الأساليب المناسبة قادرة على اكتشاف وتحديد كمية الحمض النووي الكيميائية/المخدرات-مشتقة adducts، أيتعديلات مختلفة لتقنية بوستلابيلينج ف 32، وتوظيف المشعة المسماة بتحليل المواد الكيميائية، وهي تبين بالتفصيل.

Introduction

يحدث استقلاب xenobiotics (المواد الكيميائية البيئية أو المخدرات) في هاتين المرحلتين1. المرحلتين الأولى والثانية تهدف إلى تقديم المركبات (لا للذوبان في الماء) مسعور أصلاً أكثر ماء (للذوبان في الماء)، مما يجعلها سهولة اكسكريتابل عن طريق البول أو البراز أو العرق. المرحلة الأولى تشمل (الروغان) ردود فعل الأكسدة، الحد، وهيدروكسيليشن التي تحفزها الإنزيمات مثل الفسفرة P450s (P450s، سيبس)، بيروكسيداسيس (أي.، السيكلواوكسيجيناز، كوكس)، keto الدو ريدوكتاسيس (أكرس)، وميكروسومال مونوكسيجيناسيس المحتوية على فلافين (فموس). تشمل المرحلة الأولى أيضا الحد من ردود الفعل، بوساطة مجموعة متنوعة من ريدوكتاسيس أي ميكروسومال نادف: السيتوكروم P450 ريدكتيز (البرتغال) وند (ف) سيتوسوليك H:quinone أوكسيدوريدوكتاز (NQO1)، زانتيني أوكسيديز (XO) والدهيد أوكسيديز (AO)1 . وفي المرحلة الثانية (التصريف)، المجموعات الوظيفية التي تم إرفاقها في المرحلة هي كنت متزاوجة الجزيئات القطبية الصغيرة لزيادة الأقطاب. أمثلة للإنزيمات التي تعتبر المشاركة في رد فعل للمرحلة الثانية تشمل سولفوترانسفيراسيس (سولتس)، ن، س-أسيتيلترانسفيراسيس (Nat)، ميثيلترانسفيراسيس مثل الكاتيتشول-س-ميثيلترانسفيراسي (ضميرياً)، الجلوتاثيون S– ترانسفيراسيس (جستس)، واردين ديفوسفاتي جلوكورونوسيلترانسفيراسيس (أوجتس)1. تصنيف الإنزيمات في المرحلة الأولى أو الثانية، مع ذلك، ليست جامدة، ويمكن القول أن يمكن تجميعها بعض الإنزيمات في أي من الفئتين.

هي إنزيمات P450 (المفوضية الأوروبية 1.14.14.1) الهيم المحتوية على البروتينات الموجودة في الكائنات الحية المختلفة، التي تشارك في التحول الأحيائي للعديد من المواد الكيميائية، وتحفيز على تحويل3،4. تحفيز إنزيمات P450 هيدروكسيلاتيون ركائز عديدة، مع رد فعل حيث يتم إدخال ذرة واحدة من ديوكسيجين في جزيء xenobiotics، بينما يتم تقليل الذرة الثانية من الأكسجين لتكوين الماء برد الفعل الذي يتطلب اثنين من الإلكترونات [المعادلة (1 3،) [4:

RH + O2 + نادف + روه ← ح+ + ح2س + NADP+ (1)

إنزيمات P450 المترجمة في غشاء هيولى خلايا الثدييات (نظم P450 microsomal) هم أعضاء في النظام مونوكسيجيناسي multienzyme، الذي يتضمن كذلك ريدكتيز نادف: السيتوكروم P450 (البرتغال) والسيتوكروم ب5 ، وصفته الركيزة إنزيم NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز. نظرية مقبولة عموما يفترض أن الجهة المانحة للإلكترونات هما الحاجة P450 هو نظام نادف/البرتغال. على الرغم من ذلك، الفسفرة ب5 قد تعمل أيضا كجهة مانحة للإلكترونات ل P450، هي كمانح الإلكترون الحد P450 خلال الحد الثاني من دورة رد فعل، حيث يعمل جنبا إلى جنب مع NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز2،،من34.

استغلال الثدييات إنزيمات P450 مختلف (مثلاً إنزيمات الأسر 5، 8، 11، 17، 19، 21، 24، 26 و 27) تخليق المركبات الذاتية قيمة، مثل المنشطات، واستخدامها لتقويض للمنتجات الطبيعية2،3 . أخرى CYP الثدييات الإنزيمات، مثل CYP1A2 البشرية, 9 2, 19 2، 6 2، و 3A4، استقلاب الخارجية من المواد الكيميائية المستخدمة كالمخدرات. 5 , 6 الإنزيمات أهم تحفيز عملية التمثيل الغذائي للأدوية هي سيبس الفصيلية 3A، لا سيما CYP3A4. تحويلات xenobiotics، مثل المواد المسرطنة للمحترفين والمحترفين-سميات، وساطة من CYP1A1 البشرية و 1A2، 1B1، 2A6، 2E1 و 3A42،5. معظم هذه سيبس موجودة في الكبد (باستثناء CYP1A1 و 1B1). ومع ذلك، سيبس أيضا يعبر عن عدة أجهزة اكستراهيباتيك. هذه P450s قد تكون ذات أهمية كبيرة، يغلب فيه المشاركة أنهم في الأيض بيواكتيفيشن من المواد الكيميائية (الأدوية) لرد الفعل وسيطة في هذه الأجهزة7. يتم P450s المختلفة الناجمة عن العديد من المركبات التي هي ركائز بهم، على الرغم من أن هذا ليس هو الحال بالضرورة.

إنزيمات P450 كثيرة تلعب دوراً في السمية الكيميائية (المخدرات). يمكن تحويل xenobiotics ليس فقط على إزالة السموم من الأيض، ولكنها أيضا تفعيلها للأنواع المتفاعلة التي تعديل الجزيئات الذاتية بالإضافة إلى ذلك يحمل الخصائص البيولوجية المختلفة، وعادة ما تسبب سميتها. الحمض النووي والدهون والبروتينات قد يكون هدفا للتعديل عليها برد الفعل اليكتروفيليس والجذور الناتجة عن المواد الكيميائية تم تنشيطه. في حالة الحمض النووي، وحل العديد من الردود الجينات الهامة وآلياتها الفعل معروفة2،3،،من45.

التغييرات في الحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في مكافحة نمو الخلايا، ويعتبر هذه الظاهرة هو العامل المهيمن مما أدى إلى تطور العمليات المسببة للسرطان. توليد التساهمية الحمض النووي adducts مع المواد الكيميائية لها فاعلية مسببة للسرطان هو الحكم كواحدة من أهم الخطوات في مرحلة بدء مسرطنة العمليات8،9،،من1011. قد أثبتت أن العلاقات بين تشكيل الحمض النووي adducts وتحدث توموريجينيسيس، بينما انخفاضا في كمية الحمض النووي adducts مسؤولة عن9،تشيموبريفينشن،من810، 11 , 12 , 13 , 14-تشكيل مادة مسرطنة/المخدرات-مشتقة الحمض النووي adducts يعتمد على الأسس الفردية للحمض النووي، وتتأثر في تسلسل هذه القواعد في الحمض النووي. عمليات إصلاح الحمض النووي adducts تعتمد على الموقع (على يدون أو نسخها من غير حبلا الحمض النووي) وأنواع من النوكليوتيدات تعديل تسلسل8،11،،من1215، 16.

في هذه المقالة، نحن تصف الإجراءات من خلال استخدام التحويل حفز إنزيم من المواد الكيميائية (الأدوية) للتحقيق في قوتها لتفعيلها في نواتج الأيض التي تعديل الحمض النووي (توليد الحمض النووي adducts). التساهمية الحمض النووي ملزم، ينبغي أن يكون المجمع الاختبار عادة المنشط أما عن طريق تفاعلات الأكسدة أو التخفيض، اعتماداً على العقاقير فردية. تنشيط الأكسدة أو التخفيض من اختبار المواد الكيميائية هو توسط P450-تعتمد على نظام الانزيمية موجودة في جزء سوبسيلولار ميكروسومال أو بتخفيض مع ريدوكتاسيس الحالية سواء في microsomes (البرتغال، NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز، إنزيمات P450) وفي الكسور سوبسيلولار سيتوسوليك الخلوية (NQO1، XO، AO، البيروكسيديز). والايضات رد الفعل بعد ذلك ربط الحمض النووي تشكل الحمض النووي adducts. نظراً للتفاعلات الأكسدة والتخفيض على حد سواء مهم لتنشيط العديد من العقاقير لهذه الأنواع المتفاعلة، يتم وصف الإجراءات التجريبية تستخدم النظام الأنزيمي/الحد من أكسدة. وعلاوة على ذلك، أساليب مناسبة قادرة على اكتشاف وقياس هذه الحمض النووي adducts موصوفة بالتفصيل.

اثنين إجراءات مستقلة لتحديد ما إذا كانت المادة الكيميائية اختبار، تفعيلها من خلال النظم الانزيمية، منضماً إلى الحمض النووي ينصح: 32بوستلابيلينج ف التقنية واستخدام مجمع المشعة المسمى (مثلاً.، 3ح أو 14 ج). للمرة الأولى ينصح الطيار، فحص الإنزيم بوستلابيلينج ف 32. تحديد محتوى الحمض النووي في الحلول، وتقييم الذات، يجب أن يسبق كلا الأسلوبين.

32بوستلابيلينج ف تقنية تستخدم التحلل المائي الأنزيمي للحمض النووي تعديل بواسطة المواد الكيميائية غير مشعة (مسرطن مدمني المخدرات) إلى 3´-فوسفوديوكسينوكليوسيديس، الفسفرة إضافية مع الفوسفور المشعة (32ف) في 5´- يا الموقف، وفصل المواد الكيميائية-ديوكسينوكليوتيدي أدوكتس من deoxynucleotides العادية (غير معدلة) اللوني17 (الشكل 1). هو تحلل الحمض النووي تعديل بواسطة مركب كيميائي من خلال مزيج من اندونوكليسي ونوكلاس ميكروكوككال [ااكسونوكلس]، المعروف باسم فوسفوديستريس الطحال. الخليط من تحلل الحمض النووي التي تحتوي على كلا عادي (غير معدلة) وتعديل ديوكسيريبونوكليوسيدي 3´-مونوفوسفاتيس هو رد فعل مع ATP [γ-32ف] حضور الناقل كيناز ATP و T4-بولينوكليوتيدي (غير مشعة) في pH 9.5 إلى نموذج 5´- 32ف المسمى 3´، 5´-بيسفوسفاتيس (الإجراء “ستاندارد” في الشكل 1). درجة الحموضة القلوية المستخدمة قادرة على التقليل من نشاط إنزيم كيناز T4-بولينوكليوتيدي ديفوسفوريلاتي ديوكسيريبونوكليوسيدي 3´-مونوفوسفاتيس في 3´ الموقف. الفصل والقرار من 32ف المسمى أدوكتس من deoxynucleotides المسماة التي لم يتم تعديلها بواسطة المواد الكيميائية يقوم بتبادل شاردة متعدد الاتجاهات طبقة رقيقة اللوني (TLC) على السليلوز بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) (رقم 2 ). في الخطوات الأولى والثانية شطف (في اتجاه D1 و D2)، التيد من البداية لصفيحة TLC-بي-السليلوز باستخدام حلول المياه من الكهرباء على قطعة قصيرة من المسمى deoxynucleotides (معدلة) العادي وكذلك الفوسفات [32ف] ورقة الكروماتوغرافي المطبقة على رأس لوحة TLC، بينما يتم الاحتفاظ deoxynucleotides المحتوية على المواد الكيميائية المقيدة نستعرض خصائص عمود المصباح (مادة مسرطنة/المخدرات-أدوكتس) في بداية لوحة بي-السليلوز يتعين حلها بالإضافة إلى ذلك مع عدة أنظمة مختلفة المذيبات في اتجاهات D3 و D4 (الشكل 2). تعريب أدوكتس تتم باستخدام الشاشة المحسن autoradiography؛ أدوكتس ال يفصل يتم الكشف عنها كبقع داكنة يمكن التعرف على أفلام الأشعة السينية. مجالات البقع اقتطعت من اللوحة وتستخدم لقياس النشاط الإشعاعي التﻷلؤ السائل أو سيرينكوف العد. تخزين فوسفور التصوير الأسلوب الذي قد تم تكييفه التعيين والتحديد الكمي للحمض النووي adducts في تشروماتوجرامس الكشف عن بال 32الإنزيم بوستلابيلينج ف الآن يستخدم أيضا. 18 آلة “تصوير فورية” كثيرا ما يستخدم لمثل هذا الكشف والتحديد الكمي للحمض النووي adducts. يوفر هذا الأسلوب أكثر من 10-إضعاف حساسية للكشف عن 32ف من تقنية الشاشة المحسن autoradiography19.

كميات من الحمض النووي adducts تتحدد حسب القيم النسبية adduct وسم (راؤول)، محسوبة باستخدام المعادلة (2) على النحو التالي:

الاجتماع التحضيري للمؤتمر. في adduct deoxynucleotides
راؤول =—(2)
نشاط معين من 32ف-ATP (cpm./بمول) x pmol deoxynucleotides

قيم رالس هي نسبة معدلات العد من deoxynucleotides أدوكتيد على معدلات العد الإجمالي [deoxynucleotides أدوكتيد وعادي (غير معدلة)]20،deoxynucleotides21. ومع ذلك، يستند هذا الحساب على تكافؤ وسم كفاءات adducts و deoxynucleotides العادية22. الإجراء الكلاسيكي (“قياسي”) 32تقنية بوستلابيلينج ف مناسبة لمختلف الحمض النووي adducts (ضخمة و/أو غير ضخمة adducts)، بيد أن حساسية ليست مرضية للكشف عن أدوكتس وجدت بكميات قليلة في الحمض النووي. باستخدام هذا الإجراء، مقدار adduct في 107 غير معدلة deoxynucleotides في الحمض النووي (0.3 فمول أدوكت/ميكروغرام الحمض النووي) قابلة للاكتشاف.

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من التعديلات لهذه الكلاسيكية 32الداخلي بوستلابيلينج ف رفع حساسية هذه التقنية. ما يصل إلى 10 إلى 100 ضعف حساسية أعلى لتحديد أدوكتس من 32ف العلامات قد تحقق باستخدام مستويات الحد من [γ-32ف] ATP (تكثيف الإجراءات). 23 , 24 إجراء مزيد توفير زيادة في حساسية الأسلوب بوستلابيلينج ف 32يستخدم حضانة الهضم المحتوية على الحمض النووي adducts مع نوكلاس P1 (من سيترينوم Penicillium)21 (الشكل 1). يفضل هذا الإنزيم ديفوسفوريلاتي ديوكسيريبونوكليوسيدي غير معدلة 3´-مونوفوسفاتيس، بينما deoxynucleotides مع المواد الكيميائية المقيدة (النيوكليوتيدات أدوكتيد) هي أساسا لا ركائز لهذا الإنزيم. ولذلك، لا هي فوسفوريلاتيد ديوكسيريبونوكليوسيدي ديفوسفوريلاتيد 3´-مونوفوسفاتيس (أي، ديوكسيريبونيوكليوسيدز) من T4-بولينوكليوتيدي كيناز بالفوسفات [32ف] من γ-32ف] ATP. ومع ذلك، بعض النيوكليوتيدات التي تكون فيها المواد الكيميائية ملزمة (أدوكتيد deoxynucleotides)، مثل أدوكتس arylamine استبداله في C8 ديوكسيجوانوسيني، يمكن أن بيديفوسفوريلاتيد بهذا الإنزيم. على النقيض من ذلك، معظم الأخرى أدوكتس (مثلاً، أدوكتس استبداله في ن2 من ديوكسيجوانوسيني) لم يتم ديفوسفوريلاتيد نوكلاس P1. هذا التعديل من 32ف بوستلابيلينج يجعل هذا الأسلوب إلى حد كبير أكثر حساسية، زيادة حساسيتها بأكثر من ثلاثة أوامر من حجم. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا الإصدار من 32بوستلابيلينج ف أسلوب حيث أعلى كميات من الحمض النووي (5-10 مكغ) ووجود فائض من خالية من الناقل ATP [γ- 32ف] يمكن أن تستخدم.

أسلوب آخر لإثراء أدوكتس، وصف غوبتا25، يستخدم في الفيزيائية adducts خصائص ديوكسينوكليوتيدي الضخمة، التي يمكن استخراجها في ن-وبيوتانول حضور تيترابوتيلامونيوم وكيل نقل مرحلة كلوريد (TBA) (الشكل 1) قبل [32ف] وسم الفوسفات، بينما يتم استخراج deoxynucleotides غير معدلة ضعيف بهذه المذيبات العضوية. بيد أن أدوكتس أقل مسعور، المكونة لتعديل المثال ل deoxynucleotides مع غير العطرية مويتيس ضخمة أو صغيرة مشبعة المخلفات، لا فعالية استخراج مع ن-butanol. ومن ثم، فأساسا لا يمكن الكشف عنها عندما يتم تحليلها بواسطة هذا التعديل من ال 32الأسلوب بوستلابيلينج ف.

كلا الإصدارات المذكورة سابقا من 32بوستلابيلينج ف زيادة الحساسية والتحديد الكمي للحمض النووي adducts هائلة (ما يصل إلى ثلاثة أوامر من حجم)، تكون قادرة على الكشف عن أحد adduct كل 109،10 عادي النيوكليوتيدات (0.3-3 أمول/ميكروغرام الحمض النووي). ينصح بهاتين الطريقتين لاختبار المواد الكيميائية لكفاءتها لربط تساهمي للحمض النووي، وذلك، ويرد في هذا العمل في التفاصيل.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للنظام الأساسي للرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية (311/1997، وزارة الزراعة، الجمهورية التشيكية)، التي وفقا “إعلان هلسنكي”. 1-عزل كسور ميكروسومال وسيتوسوليك كبدي إعداد الكسور سوبسيلولار الكبد (ميكروسوميس الغنية بالأنزيمات P450 أو ?…

Representative Results

استخدام البروتوكولات المذكورة هنا للاستفادة تفعيل تحفيز إنزيم (أي، P450، البيروكسيديز، ريدكتيز) للتحقيق في فاعلية من المواد الكيميائية (المواد المسرطنة/المخدرات) أن تستقلب إلى وسيطة أدى بهم التساهمية ملزمة للحمض النووي (جيل من الحمض النووي adducts)، تمكنا من حل (ط) إليه ر…

Discussion

في هذه الورقة، ثبت منهجية متاحة على نطاق واسع لدراسة فاعلية المواد الكيميائية لتكون بيواكتيفاتيد لوسيطة الأيضية، أدى إلى توليد التساهمية الحمض النووي adducts. هذا هو مسألة بالغة الأهمية، نظراً لأن تقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية أو المخدرات من تفعيل الانزيمية لنواتج الأيض توليد الت…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة “مؤسسة العلوم التشيكية” (جاكر، منحة 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image