肺癌のマウスモデルにおける糖代謝の動的変化を測定する¹⁸F-FDG PET/CT イメージングと定量組織学を活用

プロトコルで説明したすべての手順は、動物介護施設によって承認されているし、使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学ロサンゼルス校。 1 18F PET と CT の撮像。 注意: は、放射能を取り扱う際に保護具を使用します。放射能を処理するときすべての該当する規制手順に従います。 37 ° C 1 時間18F-FDG 注射18F-FDG の褐色脂肪の消費を削減する前に暖かいベッドのイメージを作成するマウスとケージを配置します。注: は、 18F-FDG の心筋の消費を減らすことができます 4 16 h のためマウスを絶食します。 マウスの重量を量る、重量を記録します。 0.5 – 37 ° C で維持麻酔チャンバーを用いた 2-3 分 2l/分で酸素の 2-3% イソフルランを使用してマウスを麻酔します。そのマウスはつま先; をつまんで麻酔されていることを確認します。反応ができなくなります、マウスが麻酔されているかどうかを観察。麻酔中は乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用します。 18F-FDG (109 分放射性半減期) を調整崩壊修正注入濃度 70-75 µCi/100 μ L の滅菌生理食塩水で希釈します。注: 最適なスキャナー用 PET 装置製造元の推奨18F 用量に従ってください。 28 G 針でインスリン注射器と 70-75 µCi を描き、線量校正器を用いた放射能線量を測定、測定と時刻を記録します。鉛シリンジ ホルダーに注射器を配置します。注: 各用量の18F-FDG 放射能の量、製造元のプロトコルによると、セシウム 137 などの標準物質に対して校正されている線量キャリブレータで測定します。読書の時間も減衰補正を決定するために記録されます。 マウスの尾の先端を刺すし、glucometer してマウスの血糖値を測定します。 温かいガーゼで 1-2 分の尾は、暖かい水に浸して。注入直前に尾静脈を拡張する 70% イソプロパノールと尾を拭いてください。ボーラス注入を介して外側尾静脈し、注射の時間を記録の18F-FDG (注射器でボリューム全体) の 100 μ L を管理します。線量校正器を使用して注射器で残りの線量を測定し、測定と時刻を記録します。注記: 注射器に残っているプローブのいくつかの量があります。注射器注射が投与されている後注射器・針の中に閉じ込め線量の減少量のためルアー ロック経由で針に接続されている以上インスリン注射器の使用お勧めします。 もとに麻酔室に注入されたマウスを置きマウスの全身循環ペット スキャンの前に 1 時間分散を経由するプローブを許可する 37 ° C で 1.5-2% イソフルラン。注: 無効にする簡単に18F-FDG 可視化マウスの下の斜面に移植腫瘍のためにスキャンする前に膀胱に有益な場合があります。 1 時間後鼻円錐形のイソフルラン麻酔下で、37 ° C でのイメージング室にマウスを置き、仰臥位で医療用テープと場所で四肢を固定します。 ペット/ct の撮像室を配置します。 PET/CT スキャナー マニュアル28に記載されているは、PET 像と CT スキャンを取得します。注: 600 のペット画像を取得光子減衰、検出器の正規化 (散乱線補正された放射性同位元素の崩壊に修正最尤推定期待値最大化を使用して再建された 650 150 keV のエネルギー ウィンドウ s適用されません)。CT 画像は、50 s 使用 50 kVp、200 μ A x 線源とフラット パネル検出器は, フェルドカンプ アルゴリズムを使用して再構築するための連続モードで取得されます。 ペット/CT の完了後は、イメージングの商工会議所から、マウスを削除そのケージに回復するようにし、なさい。それは完全には意識を取り戻したが、胸骨の横臥を維持することができますまでは、マウスを監視します。 アミド ソフトウェアにファイルし、開くをクリックして適切なファイルを選択する再生 PET/CT 画像をインポートします。 また件名の入力することでペットのデータを任意の残留量の会計処理を注射器で去った後注入の時に投与量を入力してグラム (%ID/g) あたりの投与量の % 注入の単位または単位の標準摂取量 (SUV) を変換します。重量。これを行う、ペットのデータ セットを右クリックし、検索するには、%ID/g フィールド、[基本情報] タブには、以前に記録した %ID/g を入力します。 腫瘍と正常組織 (肝臓、筋肉、肺、心臓、脳と皮下脂肪) に関心の領域 (Roi) を描画します。これを行うには、編集をクリックして、追加投資収益率を選択およびROI の図形を選択、投資収益率に名前を付けます。腫瘍と組織・ ロワを描画し、全 3 軸の興味の組織をカバーするためその寸法を調整します。注: ペット プローブ体内の動物との間の違いを考慮して腫瘍 ROI 値ことができますさらに正規化する肝臓、 18F-FDG の循環を表す最小の解糖系アクティビティでよく灌流オルガンの ROI 値。同じマウスの腫瘍と正常組織の ROI 分析が実行されます。肺の腫瘍は、正常肺に18F-FDG 保存が比較的低いので一般的に18F-FDG によって識別されます。CT は、 18F-FDG、熱心な病変特に病変を識別するためにも使用されます。分離肺のex vivo解析は、腫瘍病変のローカライズにも役立ちます。 2. 18F-FDG オートラジオグラフィー 18F-FDG、今、希薄18F-FDG を除いて次の手順 1.1-1.12 調整崩壊修正注入濃度 1,000 µCi/200 μ L 滅菌生理食塩水でイメージングのためマウスを準備します。注: 18F-FDG の高用量が使用放射線写真法の追加サンプルの処理時間と最適な検出を考慮する蛍光体プレート。 マウスを介してのイソフルランは 5% または CO2 (IACUC 承認プロシージャ) によって致命的な吸入安楽死させます。注: これは肺の組織を損傷することが、頚部転位は使用しないでください。 公開腹側表面でマウスをピン留めし、切開する前にその髪を畳に 70% エタノールをスプレーします。 正中切開を適用し横隔膜を離れて切断、胸部の壁を取り払い、胸腔内を開きます。慎重に唾液腺を除去することによって気管を公開します。できるだけ、顎に近いとして気管気管のタイトなフィットを確保するブルドッグ クランプを配置します。場所 23 G 針はブルドッグ クランプ下気管内 3 mL の注射器に接続されているし、OCT:PBS (1:1) (最適切削温度: リン酸緩衝生理食塩水) ソリューションの 〜 2 mL を注入します。注: 10 月、非常に粘性、肺の中に簡単に注射できるように PBS と混合されます。 気管から針を外し、OCT:PBS ソリューションの漏れを防ぐために注射部位にクランプする鉗子を使用します。 慎重に胸腔内から肺を削除、左葉を肺の残りの部分から分離します。場所ラベル付き cryomold で左葉を数滴 10 月でいっぱい。金型内肺葉, 肺区域を 10 月でトップに cryomold を入力します。 肺の右半分と同じ手順を繰り返します。注: 中心部に18F-FDG 信号が高いことが予想される場合、または肺腫瘍中心部の近くに位置している場合は、有益かもしれない任意のトレーサーの漏れを防ぐために中心部を削除します。また、単一の cryomold に肺全体を埋め込むことができます。OCT を使用するときに空気の泡を避けるために重要です。 ドライアイスとイソペンタンの混合物を含むにクローズドセルの押し出し発泡ポリスチレン容器に準備 cryomold を入れる長い鉗子を使用して。注: この混合物約-70 ° C で凍結のために、cryomold を配置する前にする必要があります。焼き入れ後 10 月化合物は白になります。複数のサンプルを同時に処理する場合、10 月 cryomolds で凍結試料はドライアイスに一時的に格納できます。 Cryomold から冷凍のブロックを外し、セクショニングのクリオスタットにマウントします。ミクロトームの刃 (34 °/80 mm、知名度の高い) を用いた 4 μ m 厚でブロックをセクションします。組織切片を室温で保存されているスライド ガラスに転送します。 蛍光イメージング プレート上に標本スライドを配置します。カセット プレートを置き、スライドがシフトすることを防ぐためにそれをそっと閉じます。一般的に一晩、カセットをプレートの露出のための-20 ° C のフリーザーに格納します。注: プレートとカセットは-20 ° C 使用する前に体が冷え切ってしまう前に必要があります。-80 ° C にサンプルを置くことも許容範囲です。 曝露後プレートからスライドを削除し、イメージ リーダーのプレートを読み取る。 スライドをプラスチック製のラップでラップし、-80 ° C で保存することができます、または彼らはヘマトキシリン ・ エオシン染色や免疫組織化学を覚悟することができます。 3. 組織学のため肺組織を収穫 手順 2.2 2.4 以外は、OCT:PBS ソリューションを使用する代わりに、肺を修正する 10% 通常緩衝ホルマリンの 2-3 mL を注入します。 気管から針を外し、ホルマリンの漏れを防ぐために注射部位にクランプする鉗子を使用します。慎重に胸腔内から肺を削除し、完全な固定を確保するため 16 24 時間 10% 通常緩衝ホルマリンの ~ 20 mL を含む 50 mL の円錐管に配置します。注: 最適な解剖学的特徴の保存のため肺を固定可能します。 次の日は、70% エタノール、ホルマリン固定肺に転送し、組織カセットに配置する肺を準備します。 番号 1-5図 1Dに示すように、5 の葉間ブランチ ポイントでカットするはさみを使用して葉を慎重に解剖、組織学の肺を準備し、組織カセットに非重複の向きで配置します。向きをそのままに保つために肺組織に優しく泡パッドを配置します。 パラフィン包埋まで 70% エタノールに切り裂かれた肺葉を格納します。 カセットの組織をパラフィン埋め込むし、標準的な手順を使用して染色、4 μ m 厚いセクションをカットします。 4. 組織分割とソフトウェアを用いた定量化 画像ヘマトキシリンとエオシン (H & E) は、商業マルチ スペクトル イメージング システムを使用して、1.25 倍の倍率で肺セクションを染色しました。 画像をデジタル画像キューブに変換し、H & e. の (クリックファイル、し、スペクトル ライブラリのロードに) 既製スペクトル ライブラリをロード注: スペクトル ライブラリは、単独で汚れた肺セクション、1 つのセクションだけエオシンのステンド_グラスからスペクトル画像を取得することによって事前に開発されたオープン ソースのプロプライエタリなスペクトル ライブラリに保存されたをヘマトキシリンで他のだけ染色し、ファイル (.csl)。オペレーティング ソフトウェアが必要 (取得プロトコルによって定義された)、各波長でのイメージを取得するイメージング システムがあります。それらのイメージ (「イメージ キューブ」) は、オープン ソースの独自マルチ スペクトル ファイル形式 (.im3) に格納されます。スペクトル計測ソフトウェアを使用してイメージ キューブから抽出され別のスペクトル ライブラリ ファイルに格納されています。 スペクトルUnmixボタンをクリックして擬似色 H & E 全体の肺の画像を unmix します。注: 分離 1 未満になります s。各組織の種類のピクセル数は、形態画像解析ソフトウェアを使用して定量化されました。 各画像の強度でたたみ込み, 目の波長依存の色応答の使用によるマルチ スペクトル データを同等の 3 色 (赤、緑、青) のイメージに変換することによってキューブごとにイメージを視覚化します。メモ: 結果の 3 つの画像は、標準の 24 ビット カラー イメージとして表示されます。 擬似カラーでユーザーが選択したイメージのスケーリングによって各混じり気のないイメージ (例えば、赤、緑、紫、等) の色し、1 つ標準的な 24 ビット カラー画像に他の疑似カラーの混じり気のない画像を一緒に追加。 すべての解析の既定の設定を使用します。注: 一般に、セグメンテーションのこの種は、(すなわち、どれだけうまく訓練外画像のセグメンテーション設定作品の評価) 結果の視覚的評価に依存しているのでそれは正しくトレーニングに画像を分割することが重要テストと検証のセット。 2-3 画像のトレーニング セット (人間の生検試料の 10-15) として鉄道まで上を開始それら結果、よく見るし、別の 2-3 のイメージにそのアルゴリズムを適用します。そして、完全な検証セットに結果のアルゴリズムを適用します。注: ほとんどの場合、いくつかの訓練が必要でしょう。 各マウスの葉 1-5 赤の疑似カラー腫瘍の総ピクセル数を計算することによって全肺セクションで腫瘍領域を分析します。注: 正常な組織だったが、疑似カラー緑と血/血の船が疑似カラー ピンクの図 3に示すように。各治療群の平均腫瘍負担された治療群の各マウスの総ピクセル数を測定することによって計算されます。