Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Indiana State University, el campus de anfitrión de la escuela de medicina de la Universidad de Indiana, Terre Haute. 1. preparación de conidios de a. fumigatus para infección Mientras trabaja en una campana bien ventilada, añadir 125 μl de solución stock de a. fumigatus 293 a 900 μl célula cultura grado de agua (CCGW). Luego transferir la solución para la placa de agar (MEA) del extracto mediante pipeta de Malta y extensión uniformemente con una asa de inoculación. Almacenar la placa micótica en la oscuridad a 24 ° C durante al menos 14 días y no más de 28 días. La cosecha conidios con perlas de cristal como se describió previamente9. Vierta 1.5 g de 0.5 mm perlas de vidrio sobre la placa y suavemente incline hacia adelante y hacia atrás hasta que los granos están recubiertos para extraer conidios. Recoge la mezcla de grano/conidias en un tubo cónico de 15 mL. Suspensión en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) 5 mL Dulbecco y vortex. Contar las conidias en una dilución de 50 x de sobrenadante en DPBS usando un hemocitómetro. Contar el número de conidios en la zona indicada en la figura 1 y utilizar la ecuación 1 para calcular la concentración.Factor de dilución de × #Conidia × 104conidios/mL (ecuación 1)Nota: Otras áreas de la esquina cuadrada de 4 x 4 pueden ser contadas, con la media de estas áreas utilizada como #Conidia en la ecuación 1. Figura 1: Hemocitómetro representante área usada para el conteo de conidios (caja, flecha). Diluir la suspensión de conidios con solución salina estéril (DPBS) para obtener la concentración deseada, 1.0 x 108 conidias/mL para la infección con 5 x 106 conidios/50 μl. preparar 50 μl de solución de conidios por n ‘ + 2’ ratones infectados a cuenta para el pipeteo error.Nota: Cosecha de hongos estándar y la preparación/filtración pueden ser utilizado alternativamente10. El método de cristal del grano se utiliza mejor para garantizar la obtención de muestras de conidios con antígenos hyphal pequeño/solubilidad mínima de aspiración. 2. inmunosupresión e infección del modelo murino Utilizar ratones de 7-10 semanas de edad.Nota: Ratones BALB/c, C57BL/6 (B6), deficiencia de eosinófilos (ΔdblGATA, antecedentes BALB/c) y deficiencia de células T γδ (TCRδ-/-, B6 fondo) ratones se utilizaron para este estudio. Para cada experimento, la edad y sexo-emparejado ratones (tanto machos como hembras) fueron utilizados para cada grupo. Agotar los neutrófilos vía intraperitoneal (IP) inyección de anticuerpo anti-anti-ratón-Ly – 6G de 0,1 mL (0,5 mg) en solución salina estéril a 45 º en el cuadrante derecho inferior lateral (para un programa experimental, ver figura 2). 24 h más tarde, infectar ratones por la aspiración de 5.0 x 106conidios dea. fumigatus suspendidos en 50 salina μl (ver pasos 2.4-2.10) como describió anteriormente11. Después de la infección, inyectar un subconjunto de los animales con el agente antihongos como Diacetato de caspofungina de 5 mg/kg en DPBS utilizados en este estudio (todos los días, ver figura 2). Anestesiar ratones con isoflurano 99,9% mediante una máquina de anestesia veterinaria. Coloque una toalla de papel en el piso de la cámara de inducción para recoger las heces y la orina. Colocar el ratón en la cámara de inducción, la tapa y ajuste el vaporizador a isoflurano 5% por 2 min y 30 s.Nota: Ungüento veterinario no se utiliza debido a que el tiempo total bajo anestesia es menos de 5 minutos. Reducir el vaporizador a la mitad del valor máximo de 30 s. Confirmar que el ratón correctamente está anestesiado observando lenta respiración, falta de movimiento y falta de respuesta al estímulo del pellizco del dedo del pie. Quitar el ratón de la cámara de inducción y el lugar en un tablero inclinado. Coloque el ratón con su espalda contra la Junta. Asegúrese de que sus incisivos superiores se refrenan suavemente con una goma elástica y los incisivos inferiores están sujetos ligeramente con un alambre de metal. Cuidadosamente mantenga la lengua en extensión completa con pinzas pequeñas y pipeta 50 μl de la suspensión de conidios/PBS en la base de la lengua. Sostenga la lengüeta en extensión completa; Escuche la respiración rápida y el chasquido distinto de aspiración. Mantenga durante 20 s o hasta que la suspensión es totalmente equipada. Quitar el mouse del tablero inclinado y coloque con cuidado en una jaula de observación. Tras la aspiración, el ratón debe recuperar la conciencia dentro de 1min Monitor el ratón hasta que totalmente consciente y capaz de caminar alrededor de la jaula. Los animales deben ser ubicados a 21 ° C y monitoreados dos veces al día hasta que los pulmones se cosechan. Repita el agotamiento de la infección después de 24 h de neutrófilos (paso 2.2) (figura 2). Figura 2: programa Experimental. Esta figura fue modificada de una anterior publicación8. 3. la cosecha y conservación de los pulmones de ratón para análisis histológico Profundamente anestesiar al animal con una fatal dosis de 0,1 ml de pentobarbital sódico de 390 mg/ml solución IP. Confirmar la eutanasia observando falta de respiración espontánea y la ausencia de respuesta a la estimulación de extremidades con las pinzas. Una vez sacrificados, rocíe el cadáver con etanol al 70% para esterilizar. Colocar el cadáver en un tablero de espuma cubierto con un paño absorbente.Nota: La canal debe colocarse en la espalda con alfileres asegurar los cuatro miembros a la Junta de espuma. Abrir la cavidad de la parte superior del tórax usando las tijeras con cuidado. Corte la caja torácica para exponer los pulmones y el corazón. Cortar la vena cava inferior para permitir la perfusión. Evitar cortar los vasos sanguíneos y órganos de perforación. Lentamente perfusión con 5 mL de DPBS frío en el ventrículo derecho del corazón a un ángulo de 45° con una aguja de 25 G. Repetir la perfusión con 5 mL de formalina al 10%. Exponer la tráquea y separar las almohadillas de grasa circundantes. Tenga cuidado y evitar la punción de la tráquea. Asegúrese de que el exceso de tejido conectivo se quita para poder visualizar completamente la tráquea antes de proceder. Una vez la tráquea es expuesta, coloque pinzas en la tráquea para elevarlo. Haga un pequeño agujero en la tráquea superior utilizando una aguja de 25 G.Nota: El orificio debe colocarse para que la cánula toda cabe en la tráquea. Tenga cuidado para evitar la ruptura de la tráquea. Inserte una cánula a través del agujero y hacia los pulmones. Fijar la cánula con un hilo quirúrgico atado flojamente alrededor de la tráquea.Nota: Si la tráquea está roto, puede insertarse la cánula más allá de la tráquea lo más lejos posible en la vía aérea. Utilizando una jeringa, inflar los pulmones con 1 mL de tampón de formalina de 10% a través de la cánula. Asegúrese de que la inflación de los pulmones es visible. Si no, ajustar la sonda y repetir. Una vez que los pulmones se inflan, rápidamente Retire la cánula con cuidado y tense el hilo firmemente para sellar la tráquea.Nota: Si se rompe la tráquea y los pulmones no pueden inflarse, los pulmones pueden cosecharse pero esto puede prevenir la fijación adecuada. Suavemente Retire la tráquea y los pulmones del pecho desconectar con cuidado el tejido conectivo de la tráquea con pinzas mientras tira suavemente hacia arriba en el hilo. Coloque los pulmones y la tráquea de un tubo cónico de 50 mL con 15 mL de solución de formol 10%. Coloque un extremo del hilo fuera del tubo y la tapa. Invertir el tubo para sumergir completamente la muestra en el fijador. Almacenar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 24 h o hasta que la transformación posterior.PRECAUCIÓN: Formol es peligroso. Use equipo de Protección Personal como gafas y una mascarilla. Trabajar bajo una campana química al procesar las muestras. 4. la cosecha y conservación de los pulmones de ratón de ADN carga micótica Siga los pasos 3.1 a 3.5 como se describió anteriormente en un ratón aparte. Lentamente perfusión con 10 mL de DPBS frío en el ventrículo derecho del corazón a un ángulo de 45° con una aguja de 25 G. Suprimir los pulmones con tijera y colocar en tubos de 1,5 mL etiquetado. Almacenar los pulmones a-80 ° C hasta el procesamiento posterior. Utilizar técnicas estándar como se describe (inclusión y corte) y de acuerdo con protocolos del fabricante (véase Tabla de materiales). 5. microscopía e imagen Abrir el programa de cuantificación de imagen (véase Tabla de materiales). Utilizando un microscopio de luz, obtenga al menos 4 campos distintos de las GMS manchados diapositivas (objetivo de 10 X). Asegúrese de que las imágenes son representativas de las vías respiratorias infectadas dentro de los pulmones con densidad de tejido similar.Nota: Si la densidad y la distribución de focos hyphal aparecen marcadamente diferentes entre los grupos experimentales y control, campos adicionales pueden tomarse, o el área de GMS de la sección de pulmón entero puede ser reflejado (objetivo de 4 X). Obtener imágenes de las mismas áreas del pulmón (identificado por morfología de tejido equivalente) en una sección del pulmón serial manchada con hematoxylin y eosina, si lo desea. Agregar barras de escala a las imágenes cuando sea necesario y guardar las imágenes para ser cuantificada. Seleccionar, Editar > Agregar/editar marcas de calibración > menú: elegir la línea de espesor, color y escala de tamaño de barra > haga clic en la imagen para que la barra de escala debe ser colocado. Cerrar el menú y elegir, Editar > combinar > combinar marcas de calibración > elegir guardar como > nombre del archivo y haga clic en guardar. 6. usando un programa de procesamiento de imagen para calcular la carga fúngica (figura 3) Abra un programa de procesamiento de imagen. Seleccione Archivo > carpeta con muestras a cuantificar > imagen (Figura 3A). Seleccione Imagen > tipo > convertir a ‘RGB pila’ (figura 3B). Utilice la tecla flecha derecha para seleccionar a la segunda de las tres imágenes dadas (figura 3B). Golpe “control + shift + T” para que aparezca el regulador de configuración del menú de “Umbral” (figura 3). Localice la imagen .tiff o .jpg original como referencia y abra una imagen viendo el programa (figura 3). Tire el control deslizante superior hacia la izquierda y ajuste el regulador inferior hasta que el área seleccionada (en rojo) es representativo de la imagen de la microscopia (típicamente oscilan entre 130-160 como se indica a la derecha de la barra deslizante (figura 3). Una vez seleccionado, presione “Configurar” > “Aceptar” (figura 3D). Seleccionar “Analizar” > “Establecer medidas” > comprobar “Límite de la zona, fracción de área, umbral, etiqueta de la pantalla” y dejar la configuración de la parte inferior (el menú desplegable y decimales) como por defecto > “Aceptar” (figura 3D). Áreas significativas del espacio en blanco o tinción de fondo pueden ser excluidas por la selección del tejido adecuado con una herramienta de área o polígono. Finalmente, seleccione, “Analizar” > “Medida” (debería aparecer una ventana con los datos, o una pestaña en la barra de tareas de windows aparece la etiqueta, “Resultados”) (figura 3E). Transferir los datos a un programa de análisis de datos para gráficos y análisis estadístico. Introduzca la media de los porcentajes de cuatro área para cada muestra de pulmón. 5-8 muestras son generalmente suficientes para detectar diferencias significativas entre los grupos. Si al comparar dos grupos experimentales, realizar un desapareado estudiante t-pruebas para determinar la significación. Figura 3: cuantificación del campo representante de imágenes para cada paso de GMS histológicas. (A) Seleccione Archivo > carpeta con muestras a cuantificar > seleccione imagen. (B) seleccionar imagen > tipo > convertir a ‘Pila de RGB’. Utilice la tecla flecha derecha para seleccionar a la segunda de las tres imágenes dadas. (C) Hit “control + shift + T” para que aparezca el regulador de configuración del menú de “Umbral”. Localice la imagen .tiff o .jpg original como referencia y abrir con el programa visor de fotos. Tire de la corredera superior completamente a la izquierda y ajuste el regulador inferior hasta que el área seleccionada (en rojo) es representativo de la imagen de la microscopia (típicamente desde 130-160 como se indica a la derecha del control deslizante. (D) una vez seleccionado Presione “Set” > “OK”. Seleccionar “Analizar” > “Establecer medidas” > comprobar “Límite de la zona, fracción de área, umbral, etiqueta de la pantalla” y dejar la configuración de la parte inferior (el menú desplegable y decimales) como por defecto > “OK”. (E) finalmente seleccionar “analizar” > “Medida” (debería aparecer una ventana con los datos, o una pestaña en la barra de tareas de windows aparece etiquetado como “Resultados”). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 7. ADN carga micótica Retirar los pulmones de-80 ° C y liofilizar durante al menos 4 horas (durante la noche es óptimo) o hasta que seque totalmente por un sistema seco de helada. Mientras se secan los pulmones, preparar el tampón de extracción de DNA (0.1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 y 0,5% SDS). Colocar el tampón de extracción de ADN preparado en un baño de agua de 60 º C para precalentar. También, colocar el fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) en un tubo cónico de 50 mL y permitir la separación. Coloque los pulmones liofilizados en un tubo de tapón de rosca de 2 mL con 0.2 mL de granos de cristal. Usando un batidor de grano, moler tejidos de pulmón seco para 15-30 s hasta que se forme un polvo fino. Agregar 0,8 mL de tampón de extracción de ADN caliente a cada tubo y agitar bien. Incubar cada tubo durante 15 min en un baño del grano de 65 ° C y luego vórtice antes de incubar un adicional 15 min. Después de incubar, vortex y centrifugar los tubos a 25.000 x g durante 10 minutos. 3 juegos de tubos de 1,5 mL de la etiqueta para cada una de las muestras y transferir la capa superior del sobrenadante en un set de tubos. Tenga cuidado al pipetear la capa acuosa superior para evitar molestar a la capa media. Añadir igual volumen de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol y mezclar bien. Luego centrifugar a 25.000 x g durante 15 min antes de pipetear la capa superior en la segunda serie de tubos. Agregar igual volumen de cloroformo cloroformo: isoamílico, mezcle bien y centrifugue a 25.000 x g durante 10 minutos con cuidado la pipeta a la capa superior en el tercer juego de tubos. Añadir 500 μl de isopropanol 50 μl NaoAc (pH 5,2), mezclar bien y muestras a incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego centrifugar a 25.000 x g durante 30 minutos y decantar el sobrenadante. Lavar el pellet de ADN con 750 μl de etanol frío al 70% hielo y centrifugar durante 5 minutos a 25.000 x g. decantar el etanol y deje que seca el pellet al aire en los tubos en un campanas durante 40 minutos. Resuspender el pellet seco en 300 μL de tampón TE.Nota: El ADN puede ser almacenado a-20 ° C hasta cuantificado. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro y preparar 100 μl de 0,2 μg/μl de cada muestra de ADN para el análisis de qPCR. Realizar una qPCR estándar por triplicado como se describió anteriormente con 1 μg de muestra de ADN, hongos 18S rDNA cartilla, y sonda fija con un extintor de sonda modificada (5′- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3′) de12,13. Preparar una curva estándar de ADN genómico de a. fumigatus y calcular la concentración de ADN fúngico en pg en cada muestra utilizando el reportero promedio valores de Ct del tinte. Parcela la pg/μg de ADN fúngico con error estándar de la media. Realizar un estudiante t-análisis para determinar la significación de la prueba.Nota: como menos tóxico alternativa a la extracción de DNA de fenol-cloroformo utilizada en el presente documento, columna basado en la extracción de ADN se pueden usar paquettes.