Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comité de Indiana State University de uso, o campus de anfitrião da Indiana University School of Medicine e cuidado Animal — Terre Haute. 1. preparação da . fumigatus conídios por infecção Enquanto trabalhava em uma coifa ventilada, adicione 125 µ l de solução-mãe de a. fumigatus 293 para 900 µ l célula cultura classe água (CCGW). Em seguida, transferi a solução para placa de agar (MEA) extrato através de pipeta de malte e espalhe uniformemente com um loop inoculando. Armazene a placa fúngica no escuro a 24 ° C durante pelo menos 14 dias e não mais de 28 dias. Conídios de colheita usando contas de vidro, como anteriormente descreveram9. Despeje 1,5 g de 0.5 mm grânulos de vidro na placa e suavemente incliná-lo para a frente e para trás até que os grânulos são revestidos a fim de extrair conídios. Recolha a mistura do grânulo/conídios em um tubo cônico de 15 mL. Suspenda em de 5ml Dulbecco tampão fosfato salino (DPBS) e vortex. Conte os conídios em uma diluição de 50 x de sobrenadante na DPBS usando um hemocytometer. Contar o número de conídios na área mostrada na Figura 1 e usar a equação 1 para calcular a concentração.Fator de diluição de #Conidia × × 104= conídios/mL (equação 1)Nota: Áreas de canto quadrado 4×4 adicionais podem ser contadas, com a média dessas áreas usadas como #Conidia na equação 1. Figura 1: Hemocytometer representante área utilizada para a contagem de conídios (caixa, seta). Diluir a suspensão de conídios com solução salina estéril (DPBS) para obter a concentração desejada, 1,0 x 108 conídios/mL para a infecção com 5 x 106 conídios/50 µ l. preparar 50 µ l de solução de conídios por ‘ n + 2′ ratos para ser infectado a conta para pipetar erro.Nota: Padrão fungo colheita e preparação/filtragem podem ser usado alternativamente10. O método de grânulo de vidro é melhor usado para assegurar que amostras de conídios com mínimos pequeno/solúvel hifas antígenos são obtidas por aspiração. 2. imunossupressão e infecção do modelo murino Use ratos 7-10-week-old.Nota: BALB/c, C57BL/6 (B6), deficiência de eosinófilo (ΔdblGATA, fundo BALB/c) e deficiência de células T γδ (TCRδ-/-, fundo de B6) ratos foram utilizados para este estudo. Em cada experimento, idade e gênero-combinadas ratos (machos e fêmeas) foram utilizados para cada grupo. Empobrecem os neutrófilos via (IP) injeção intraperitoneal de anticorpo anti-mouse-Ly – 6G de 0,1 mL (0,5 mg) em soro fisiológico estéril a 45° no quadrante inferior direito lateral (para um horário experimental, ver Figura 2). 24h depois, infectar camundongos por aspiração com 5,0 x 106a. fumigatus conídios suspensos em 50 soro fisiológico estéril µ l (ver passos 2.4-2.10) como descrito anteriormente11. Após a infecção, injetar um subconjunto de animais com agente antifúngico como diacetato de caspofungina 5mg/kg em DPBS utilizado neste estudo (diariamente, ver Figura 2). ANESTHETIZE ratos com 99,9% de isoflurano usando uma máquina de anestesia veterinária. Coloque uma toalha de papel no chão da câmara de indução para pegar as fezes e urina. Posicione o mouse na câmara de indução, fixe a tampa e definido o vaporizador com isoflurano de 5% para 2 min e 30 s.Nota: Pomada de veterinário não é usada porque o tempo total sob anestesia é menos de 5 min. Reduzir o vaporizador para metade da configuração máxima por 30 s. Confirmar que o mouse é devidamente anestesiado, observando desacelerou para respirar, falta de movimento e falta de resposta ao estímulo de dedo-pinch. Retire o mouse da câmara de indução e coloque sobre uma prancha inclinada. Coloque o mouse com as costas contra a placa. Certifique-se de que seus incisivos superiores são tolhidos suavemente com um elástico e incisivos inferiores são tolhidos suavemente com um fio de metal. Cuidadosamente, segure a língua em extensão completa com pequenas pinças e pipeta, 50 µ l de suspensão de conídios/PBS na base da língua. Segure a língua em extensão completa; Ouça por respiração rápida e o ruído de clique distinto de aspiração. Segure por 20 s ou até suspensão é totalmente aspirado. Retire o mouse da prancha inclinada e Coloque suavemente em uma gaiola para observação. Após a aspiração, o rato deve recuperar a consciência dentro de 1 min. Monitor o mouse até totalmente consciente e capaz de andar por aí a gaiola. Os animais devem ser alojados a 21 ° C e monitorados, duas vezes ao dia, até que os pulmões são colhidos. Repita o esgotamento da infecção pós 24h por neutrófilos (passo 2.2) (Figura 2). Figura 2: programação Experimental. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação8. 3. colheita e preservação dos pulmões de Mouse para análise histológica Profundamente anestesia o animal com uma dose fatal de 0,1 ml de 390 mg/ml pentobarbital de sódio solução IP. Confirme a eutanásia, observando a falta de respiração espontânea e ausência de resposta à estimulação do membro com uma pinça. Uma vez que a eutanásia, pulverize a carcaça com etanol a 70% para esterilizar. Coloque a carcaça em uma placa de espuma coberta com um absorvente.Nota: A carcaça deve ser colocada em suas costas com pinos de fixação todos os quatro membros para a placa de espuma. Abra a cavidade superior do peito usando tesouras com cautela. Corte a caixa torácica para expor os pulmões e o coração. Corte a veia cava inferior para permitir a perfusão. Evite cortar os vasos sanguíneos e perfurar órgãos. Perfundir lentamente com 5 mL de DPBS frio no ventrículo direito do coração em um ângulo de 45° com uma agulha 25-G. Repita a perfusão com 5 mL de formol a 10%. Cuidadosamente, expor a traqueia e separar as almofadas de gordura ao redor. Use cautela e evitar perfurar a traqueia. Garantir a que remoção do excesso de tecido conjuntivo para visualizar totalmente a traqueia antes de prosseguir. Uma vez que a traqueia é exposta, coloque a pinça sob a traqueia para elevá-lo. Fazer um buraco pequeno na traqueia superior usando uma agulha 25-G.Nota: O buraco deve ser posicionado para que a cânula toda se encaixa na traqueia. Tome cuidado para evitar a ruptura da traqueia. Introduza uma cânula através do buraco e para os pulmões. Fixe a cânula com um fio cirúrgico amarrado frouxamente em torno da traqueia.Nota: Se a traqueia é rompida, a cânula pode ser inserida além da traqueia na medida do possível, na via aérea. Usando uma seringa, infle os pulmões com 1 mL de tampão de formalina 10% através da cânula. Certifique-se de que a inflação dos pulmões é visível. Caso contrário, ajustar o cateter e repetir. Uma vez que os pulmões são inflados, rapidamente remover a cânula com cuidado e aperte o fio firmemente para selar a traqueia.Nota: Se é rompida a traqueia e os pulmões não podem ser inflados, os pulmões ainda podem ser capturados, mas isso pode impedir a fixação adequada. Remova delicadamente a traqueia e os pulmões do peito desconectando cuidadosamente o tecido conjuntivo da traqueia com pinça enquanto puxando suavemente para cima no thread. Coloque os pulmões e traqueia em um tubo cónico de 50 mL com 15 mL de tampão de formalina 10%. Coloque uma das extremidades do segmento fora do tubo e feche a tampa. Inverta o tubo para submergir completamente a amostra no fixador. Armazene as amostras à temperatura ambiente pelo menos 24 h ou até processamento adicional.Atenção: Formalina é perigosa. Use equipamento de protecção adequado incluindo uma máscara e óculos. Trabalhar sob uma capa de química durante o processamento de amostras. 4. colheita e preservação dos pulmões de Mouse para DNA carga fúngica Siga os passos 3.1-3.5 como descrito acima em um mouse separado. Perfundir lentamente com 10 mL de DPBS frio no ventrículo direito do coração em um ângulo de 45° com uma agulha 25-G. Impostos especiais de consumo os pulmões com uma tesoura e coloque em tubos etiquetados 1,5 mL. Armazene os pulmões a-80 ° C até o processamento adicional. Use técnicas padrão conforme descrito (incorporação e corte) e de acordo com protocolos do fabricante (ver Tabela de materiais). 5. microscopia e imagem Abra o programa da imagem latente da quantificação (ver Tabela de materiais). Usando um microscópio de luz, obter pelo menos 4 campos distintos dos GMS manchados slides (objetivo de X 10). Certifique-se de que as imagens são representativas das vias aéreas dentro do pulmão com similar densidade do tecido infectadas.Nota: Se a densidade e a distribuição dos focos das hifas aparecem visivelmente diferentes entre os grupos experimentais e controle, campos adicionais podem ser tomados, ou a área de GMS da seção de pulmão inteiro pode ser fotografada (objetivo de X 4). Obter imagens das mesmas áreas do pulmão (identificados pela morfologia do tecido equivalente) em uma seção de pulmão serial corada com hematoxilina e eosina, se desejado. Adicionar barras de escala para as imagens, se necessário e guardar as imagens para ser quantificada. Selecionar, Editar > Adicionar/editar marcas de calibração > Menu: escolher o tamanho de barra de escala, a cor e a espessura de linha > clique na imagem para ver onde a barra de escala é para ser colocado. Fechar o Menu e escolher, Editar > Merge > Mesclar marcas de calibração > escolher arquivo salvar como > nome do arquivo e clique em salvar. 6. usando um programa de processamento de imagem para calcular a carga fúngica (Figura 3) Abra um programa de processamento de imagem. Selecione Arquivo > pasta com amostras de quantificar > imagem (Figura 3A). Selecione a imagem > tipo > converter para “Pilha” de RGB (Figura 3B). Use a tecla de seta para a direita para selecionar a segunda das três imagens dada (Figura 3B). Bateu “control + shift + T” para que apareça o ajustador de configurações do menu de “Limiar” (Figura 3). Localize a imagem original,. TIFF ou. jpg como referência e abre com uma imagem de visualização do programa (Figura 3). Puxar o controle deslizante superior todo o caminho para a esquerda e ajuste o controle deslizante inferior até a área selecionada (em vermelho) é representante da imagem microscopia (normalmente variando de 130-160 como indicado à direita do controle deslizante (Figura 3). Uma vez selecionado, pressione “Set” > “Okey” (Figura 3D). Selecione “Analisar” > “Definir medições” > “Limite de área, a fração de área, ao limiar, o rótulo de exibição” e deixar as configurações de fundo (o menu drop-down e decimais) como padrão > “Okey” (Figura 3D). Áreas significativas de espaço em branco ou coloração de fundo podem ser excluídas pela seleção do tecido apropriado com uma ferramenta de área ou polígono. Finalmente, selecione, “Analisar” > “Medida” (deverá aparecer uma janela com dados, ou uma guia na barra de tarefas da windows aparecerá rotulado, “Resultados”) (Figura 3E). Transferir os dados para um programa de análise de dados para gráficos e análise estatística. Digite a média das percentagens quatro área para cada amostra de pulmão. 5-8 amostras são geralmente suficientes para detectar diferenças significativas entre os grupos. Se comparar dois grupos experimentais, executar um student não pareado t-teste para determinar o significado. Figura 3: quantificação de campo representante screenshots de cada etapa de GMS histológicas. (A) Selecionar arquivo > pasta com amostras de quantificar > selecionar imagem. (B) selecione imagem > tipo > converter para “Pilha de RGB”. Use a tecla de seta para a direita para selecionar a segunda das três imagens determinadas. (C) Hit “control + shift + T” para que apareça o ajustador de configurações de menu “Limiar”. Localize a imagem original,. TIFF ou. jpg como referência e abrir com o programa visualizador de fotos. Puxe o deslizante superior até deixou e ajuste o controle deslizante inferior até a área selecionada (em vermelho) é representante da imagem microscopia (normalmente variando de 130-160 como indicado à direita do controle deslizante. (D) uma vez selecionado pressione “Set” > “Okey”. Selecione “Analisar” > “Definir medições” > “Limite de área, a fração de área, ao limiar, o rótulo de exibição” e deixar as configurações de fundo (o menu drop-down e decimais) como padrão > “Okey”. (E) finalmente selecione “analisar” > “Medida” (deverá aparecer uma janela com dados, ou uma guia na barra de tarefas da windows aparecerá rotulado “Resultados”). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. DNA carga fúngica Remover os pulmões de-80 ° C e lyophilize pelo menos 4 h (durante a noite é o ideal) ou até completamente seco por um sistema de gelo seco. Enquanto os pulmões estão secando, prepare o tampão de extração de DNA (NaCl 0,1 M, 10 mM EDTA pH 8.0, 10mm Tris HCl pH 8.0 e 0,5% SDS). Coloque o buffer de extração de DNA preparado em um banho de água de 60 ° C para pré-aquecer. Além disso, coloque o fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) em um tubo cónico de 50 mL e permitir a separação. Coloque os pulmões liofilizados em um tubo de 2 mL de tampão de parafuso com 0,2 mL de esferas de vidro. Usando um batedor do grânulo, moa o tecido de pulmão seco por 15-30 s até formar um pó fino. Adicione 0,8 mL de tampão de extração de DNA quente a cada tubo e vórtice bem. Incube cada tubo por 15 min em um banho de grânulo de 65 ° C e em seguida vórtice antes incubando durante um 15 minutos adicionais. Após a incubação, vórtice e, em seguida, centrifugar tubos em 25.000 x g durante 10 minutos. Rotular 3 conjuntos de tubos de 1,5 mL para cada uma das amostras e transferir a camada superior do líquido sobrenadante para um conjunto de tubos. Tenha cuidado durante a pipetagem a camada aquosa superior para evitar perturbar a camada média. Adicione igual volume de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio e misture bem. Centrifugar a 25.000 x g, durante 15 min antes de Pipetar a camada superior para o segundo conjunto de tubos. Adicionar um volume igual de clorofórmio clorofórmio: isoamílico, misture bem e centrifugar a 25.000 x g durante 10 min. pipeta com cuidado a camada superior para o terceiro conjunto de tubos. Adicionar 500 µ l de isopropanol e 50 µ l NaoAc (pH 5.2), misture bem e permitir a amostras de incubação à temperatura ambiente por 10 min. Centrifugar a 25.000 x g por 30 min e decante o sobrenadante. Lavar o sedimento de DNA com 750 µ l de etanol a 70% frio gelo e centrifugar por 5 min em 25.000 x g. decantar o etanol e permitir que as bolinhas de ar seco nos tubos em um exaustores de fumos por 40 min. Resuspenda as pelotas secas em 300 µ l de tampão TE.Nota: O DNA pode ser armazenado a-20 º C até quantificada. Quantificação de DNA utilizando um espectrofotômetro e prepare-se 100 µ l de 0,2 µ g / µ l de cada amostra de DNA para análise de qPCR. Executar um padrão qPCR em triplicado, conforme descrito anteriormente com 1 µ g de amostra de DNA, fúngicas 18S rDNA da primeira demão, e sonda define com um quencher da sonda modificado (5′- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3’)12,13. Preparar uma curva padrão de DNA genômico da . fumigatus e calcular a concentração de DNA fúngico em pg em cada amostra utilizando o repórter médio tingir valores de Ct. Sinopse o pg / µ g de DNA fúngico com erro padrão da média. Executar t de um estudante-teste de análise para determinar o significado.Nota: como um menos tóxica alternativa para a extração de DNA de fenol-clorofórmio usada neste documento, coluna com base em extração de DNA kits podem ser usados.