アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

動物のすべてのプロシージャは、動物愛護とインディアナ州立大学の使用委員会、インディアナ大学医学部のホストのキャンパスによって承認された-テレ ホート。 1. 感染症のためA. fumigatus分生子の準備 作業中に換気の発煙のフード、900 μ L 細胞培養グレード水 (CCGW) にA. fumigatus 293 原液の 125 μ L を追加します。麦芽エキス寒天培地 (MEA) 板ピペットと接種ループと均等にソリューションを転送します。 24 の ° C、少なくとも 14 日間、28 日以上で暗闇の中で真菌のプレートを格納します。 上記9としてガラス製のビーズを使用して分生子を収穫します。 注ぐ 1.5 g 0.5 mm のプレートの上にガラス製のビーズとビーズが分生子を抽出するために被覆されるまで前後軽く傾斜それ。15 mL コニカル チューブ ビーズ/胞子混合物を収集します。5 mL ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) と渦を中断します。 診断 DPBS の上澄みの 50 倍希釈の分生子をカウントします。図 1に示す領域で分生胞子の数をカウントし、濃度を計算する方程式 1を使用します。#Conidia × 希釈ファクター × 104= 胞子/mL (式 1)注: 追加の 4 x 4 正方形の角の部分と思われる、式 1の #Conidia として使用されるこれらの地域の平均値を持つ。 図 1: 検定代表エリア分生胞子を数えるために使用 (ボックス、矢印)。 ごと滅菌生理食塩水 (DPBS) 望ましい集中、1.0 x 108分生胞子/mL 分生胞子液の準備 50 μ L 5 x 106分生胞子/50 μ L. で感染を取得すると分生胞子懸濁液を希釈 ‘ n + 2′ ピペッティングのアカウントに感染するマウスエラーです。注: 標準菌収穫と準備/ろ過代わりに使用される10があります。吸引の最小限の小/水溶性菌糸抗原と分生胞子サンプルが得られるように、ガラスビード法が適しています。 2. 免疫抑制と感染マウスモデルの 7-10 週齢のマウスを使用します。注: BALB/c、C57BL/6 (B6)、好酸球欠損 (ΔdblGATA, balb/c 背景) と γδ T 細胞欠損 (TCRδ-/-、B6 背景) マウスはこの研究のために使用されました。各実験、年齢し、性別をマッチさせた、(男性と女性) のマウスはグループごとに使用されました。 45 ° 外側右下の象限に滅菌生理食塩水で 0.1 mL (0.5 mg) 反-mouse-Ly-6 G 抗体の腹腔内 (IP) 注入を介して好中球を使い果たす (実験的スケジュールでは、図 2を参照)。 24 h 後、50 で中断 106A. fumigatus胞子 x 5.0 と吸引によって、マウスに感染 μ L 滅菌生理食塩水 (手順 2.4 2.10 参照) 前述したように11。本研究で用いた DPBS で 5 mg/kg キャスポファンギン ジアセテートなど抗真菌剤と動物のサブセットを注入、感染 (毎日、図 2を参照)。 獣医麻酔機を使用して 99.9% イソフルランとマウスを麻酔します。 大便と小便をキャッチする誘導室の床にペーパー タオルを配置します。 誘導チャンバーにマウスを置き、蓋を固定、2 分の 30 5% イソフルラン気化器に設定 s。注: 麻酔下に合計時間は 5 分もかかりませんので、獣医軟膏は使用されません。 気化器を 30 に設定最大値の半分に減らす s。 確認呼吸、運動の不足、つま先ピンチ刺激への応答の欠如マウスは正しく観察することによって麻酔を鈍化しました。 誘導室と傾斜基板上の場所から、マウスを削除します。その背中を板にマウスを置きます。その上顎中切歯がゴムバンドで軽く拘束された下顎前歯部は優しく金属ワイヤーで拘束されたことを確認します。 慎重に小さな鉗子と舌のベースの分生胞子/PBS を懸濁液の 50 μ L をピペット完全拡張子で舌を保持します。 完全な拡張子; で舌を保持します。急速な呼吸および誤嚥の明確なクリック ノイズを聞く。20 は、s または懸濁液は完全に吸気まで。 傾斜基板からマウスを取り外し、観察用ケージをそっと置き。 以下の吸引、マウスが意識を取り戻す 1 分モニター内マウス完全に意識し、ケージの周りに歩くことができるまで。動物は 21 ° C で収容され、肺が収穫されるまで、1 日 2 回監視する必要があります。 好中球 (手順 2.2) 24 h 後感染症 (図 2) の枯渇を繰り返します。 図 2: 実験的スケジュール。この図は、以前の文書8から変更されました。 3. 収穫とマウスの肺の組織学的解析のための保全 深く 390 mg/ml ペントバルビ タール ナトリウム ソリューション IP の 0.1 ml の致命的な線量を持つ動物を麻酔します。 安楽死をピンセットで自発呼吸の欠如と手足刺激に対する反応の有無を観察することによって確認します。安楽死、一度 70% エタノール消毒すると死体をスプレーします。 吸収パッドで覆われている発泡ボードに死体を配置します。注: 死体は、発泡ボードにすべての 4 つの手足を固定ピンでその裏に配置する必要があります。 慎重にはさみを使用して上位胸の空洞を開きます。肺と心臓を公開するために胸郭を切り取る。灌流のために下大静脈をカットします。血管を切断し、臓器穿刺を避けるため。 ゆっくりと 25 G 針を 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS 5 mL で灌流します。10% ホルマリン 5 mL で灌流を繰り返します。 慎重に気管を公開し、周囲の脂肪パッドをデタッチします。注意を払い、気管を刺さない。余分な結合組織が完全に進む前に気管を視覚化するために削除されますを確認します。一度気管を公開すると、昇格する気管の下で鉗子を配置します。 25 G の針を使用して上部気管に小さな穴を突きます。注: 全体のカニューレが気管内に収まるように、穴を配置必要があります。気管の破裂を避けるために注意を使用します。 穴から肺に向かって、カニューレを挿入します。カニューレを気管に緩く巻きつけ手術スレッドで固定します。注: 気管が破裂すると場合に、過去の可能な限り気道で気管カニューレが挿入されるかもしれません。 注射器を使用して、1 mL のカニューレを通して 10% ホルマリン バッファーを有する肺を膨らませます。肺のインフレ率が表示されることを確認します。そうでない場合は、カテーテルを調整しを繰り返します。肺が膨張すると、一度すぐに注意してカニューレを取り外し、安全に気管を封鎖するねじ締め。注: 場合は気管が破裂して、肺が膨張することはできません、肺はまだ収穫されるかもしれないが、これは適切な固定を防ぐことができます。 慎重慎重にスレッドで軽く持ち上げながら鉗子で気管の結合組織を切断することによって気管と肺に胸から取り外します。バッファーを 10% ホルマリン 15 mL と 50 mL の円錐管に肺や気管を配置します。チューブ外スレッドの一方の端を置き、キャップをシールします。定着剤のサンプルが完全に水没するチューブを反転します。 常温 24 時間少なくともまたはさらに処理までサンプルを格納します。注意:ホルマリンは危険です。ゴーグルとフェイス マスクを含む適切な個人用保護具を着用します。サンプルを処理するときに化学のフードの下で動作します。 4. 収穫と DNA 真菌負担のマウス肺の保全 別のマウスに前述の手順 3.1 3.5。 ゆっくりと 25 G 針、10 ml 45 ° の角度で心臓の右心室に冷たい DPBS の灌流します。 ハサミで肺を切除し、ラベル付き 1.5 mL チューブに配置します。 さらに処理まで-80 ° C で肺を格納します。 前述の (埋め込み、区分)、製造元のプロトコル (材料の表を参照) によると、標準的な手法を使用します。 5. 顕微鏡とイメージング 定量化するイメージング プログラムを開く (材料の表を参照してください)。 光学顕微鏡を使用して、スライド (対物レンズ 10 倍) をステンド グラス GMS の少なくとも 4 の異なるフィールドを取得します。画像が同じような組織の密度と肺内感染した気道の代表であることを確認します。注: 密度と菌糸の巣の分布表示コントロール群と実験群の間に著しく異なった場合追加フィールドを取得ことがあります、または全肺セクションの GMS のエリア イメージを作成する可能性があります (4 X 目標)。必要に応じて、シリアル肺切片ヘマトキシリンとエオシン、上肺 (同等組織形態によって識別される) の同じ領域の画像を取得します。 必要に応じて、画像にスケールバーを追加し、定量化する画像を保存します。、[編集] > 追加/編集校正マーク > メニュー: 線の太さ、色、スケール バーのサイズを選択 > スケール バーが配置される画像をクリックします。メニューを閉じるし、編集を選択 > マージ > マージ校正マーク > ファイルの [名前を付けて保存を選択 > ファイル名を指定して保存します。 6. 画像処理プログラムを使用して真菌の負担 (図 3) を計算するには 画像処理プログラムを開きます。ファイルを選択 > を定量化するためのサンプル フォルダー > イメージ (図 3 a)。画像を選択 > タイプ >「RGB スタック」(図 3 b) に変換します。 3 つの指定されたイメージ (図 3 b) の 2 番目の選択に右矢印キーを使用します。「コントロール + シフト + T」をヒットさせる「しきい値」メニューの設定調整器 (図 3)。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して映像プログラム (図 3) を開きます。 左端に上のスライダーを引っ張るし、下のスライダーを調整 (赤) で選択領域が (通常に至る 130-160 (図 3) のスライダーの右側に示すよう顕微鏡画像の代表になるまで。 選択すると、一度プレス「設定」>”OK”(図 3 D)。「分析」を選択 >「測定の設定」>「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベル”をチェックし、、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し >”OK”(図 3 D). ホワイト スペースまたは背景の汚損の重要な地域エリアまたは多角形ツールを使って適切な組織の選択除外されるかもしれない。 最後に、「分析」を選択 >「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」はラベル表示されます) (図 3E)。グラフのためのデータ解析プログラムにデータを転送および統計分析。 各肺サンプルの 4 つの領域率の平均値を入力します。5-8 サンプルは、グループ間に有意差を検出するには不十分です。2 つの実験群を比較すると、対になっていない学生のtを実行-意義を判断するテスト。 図 3: GMS 組織の各ステップの代表スクリーン ショット フィールド定量化します。(A) ファイルを選択 > を定量化するためのサンプル フォルダー > 選択イメージ。(B) 画像の選択 > タイプ >「RGB スタック」に変換します。右矢印キーを使用して、2 番目の 3 つの特定の画像を選択します。(C) ヒット「コントロール + シフト + T」「しきい値」メニューの設定調整を持ち出す。参照として元 .tiff または .jpg 画像を検索して写真ビューアー プログラムで開きます。ずっと左 (赤) で選択領域が (通常に至る 130 160 示されるスライダーの右側に顕微鏡画像の代表になるまで下のスライダーを調整する上部のスライダーを引っ張る。(D) 選択したプレス「設定」>”OK”。「分析」を選択 >「測定設定」>「面積、面積率、制限しきい値、表示ラベルに」をチェックし、既定値として下の設定 (ドロップ ダウン メニューと小数点以下の桁数) を残し >”OK”。(E) 最後に選択「分析」>「測定」(データ ウィンドウが表示されます、または windows タスク バー上のタブは、「結果」をラベル表示されます)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 7. DNA 真菌負担 -80 ° C から肺を削除し、少なくとも 4 時間のため凍乾 (一晩最適です) または凍結乾燥システムによって完全に乾燥するまで。 肺が乾燥すると、DNA 抽出バッファー (0.1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0、10 mM トリス塩酸 pH 8.0、および 0.5 %sds) を準備します。 あらかじめ温めて 60 ° C の水浴の準備の DNA 抽出バッファーを配置します。また、フェノールを配置: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) 50 mL コニカル チューブの分離を可能にします。 2 mL スクリュー キャップ チューブ 0.2 ml のガラス製のビーズに凍結乾燥肺を配置します。微粉末となるまで、15-30 秒の乾燥肺組織を挽くビード ・ ビーターを使用して。 各管と渦にも 0.8 mL ウォーム DNA 抽出バッファーを追加します。さらに 15 分間インキュベートする前に各チューブ 65 ° C ビーズお風呂し渦で 15 分間、インキュベートします。インキュベート後、渦とし遠心分離機 25,000 x g で 10 分間のチューブします。 各サンプルのラベルを 1.5 mL チューブの 3 セットとチューブの 1 つのセットに上澄みの最上位のレイヤーを転送します。水性トップ層をピペッティングしながら中間層を妨害を避けるために注意を使用します。 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの等しいボリュームを追加し、よく混ぜます。チューブの 2 番目のセットに上位層をピペットで移す前に、15 分 25,000 × g で遠心分離します。 クロロホルム: イソアミル クロロホルムの等量を加えてよく混ぜ 25,000 x g で 10 分間上層を慎重にピペットで遠心分離機のチューブの 3 番目のセットに。 追加 500 μ L のイソプロパノール 50 μ L NaoAc (pH が 5.2)、ミックスと 10 分間室温でインキュベートするサンプルを許可します。30 分間 25,000 × g で遠心分離し、上清をデカントします。 25,000 x g デカント エタノールに 750 μ L 氷冷 70% エタノールや 5 分間遠心分離で DNA の餌を洗浄し、40 分間ヒューム フードのチューブで空気にペレットを乾燥を許可します。 TE バッファーの 300 μ L の乾燥ペレットを再懸濁します。注: DNA は定量化されるまでの-20 ° C で保存されるかもしれない。 分光光度計を用いた DNA の定量化し、qPCR 分析用各 DNA のサンプルの 0.2 μ g/μ L の 100 μ L を準備します。 真菌 18S rDNA のプライマー、DNA サンプルの 1 μ g と前述したように 3 通標準 qPCR を実行し、変更されたプローブ クェンチャーのプローブを設定します (5’-/56-ファム/AGC CAG CGG/禅/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ‘)12,13。 A. fumigatus genomic DNA から標準曲線を準備し、各 pg 菌 DNA の濃度を計算する平均のレポーターを使用してサンプルを染める Ct 値。 平均値の標準誤差との真菌 DNA の pg/μ をプロットします。学生のtを実行-テストの意義を判断する分析。注: としてより少なく有毒な代わりにここで使用されるフェノール クロロホルム DNA 抽出、カラムベース DNA 抽出キットを使用することができます。