Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

Tutte le procedure di animali sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato di Indiana State University, il campus di host dell’Indiana University School of Medicine — Terre Haute. 1. preparazione di a. fumigatus conidi per infezione Mentre si lavora in una cappa ben ventilata, aggiungere 125 µ l di soluzione madre di a. fumigatus 293 900 µ l cella cultura acqua di qualità (CCGW). Quindi trasferire la soluzione per piastra di agar (MEA) estratto tramite pipetta di malto e distribuire uniformemente con un’ansa da inoculo. Conservare la piastra fungina al buio a 24 ° C, per almeno 14 giorni e non più di 28 giorni. Conidi raccolto usando i branelli di vetro come precedentemente descritto9. Versare 1,5 g di 0,5 mm perle di vetro sulla piastra e inclinare delicatamente avanti e indietro fino a quando le perline sono rivestite per estrarre conidi. Raccogliere la miscela di tallone/conidi in una provetta conica da 15 mL. Sospendere in tampone fosfato salino (DPBS) di 5ml Dulbecco e vortex. Contare i conidi in una diluzione di 50x del surnatante in DPBS utilizzando un emocitometro. Contare il numero di conidi nella zona indicata in Figura 1 e utilizzare 1 equazione per calcolare la concentrazione.Fattore di diluizione × #Conidia × 104= conidi/mL (equazione 1)Nota: Ulteriori aree di angolo quadrato 4×4 possono essere contati, con la media di queste aree usate come #Conidia in equazione 1. Figura 1: Emocitometro rappresentanza area utilizzata per conidi contando (scatola, freccia). Diluire la sospensione di conidi con soluzione salina sterile (DPBS) per ottenere la concentrazione desiderata, 1.0 x 108 conidi/mL per l’infezione con 5 x 106 conidi/50 µ l. preparare 50 µ l di soluzione di conidi a ‘ n + 2′ topi infetti al conto per il pipettaggio errore.Nota: Standard fungo raccolto e preparazione/filtrazione possono essere usati in alternativa10. Il metodo del branello di vetro è meglio utilizzato per garantire che i campioni di conidi con minimi piccolo/solubile antigeni hyphal sono ottenuti per aspirazione. 2. l’immunosoppressione e infezione del modello murino Utilizzare 10-week-old 7 topi.Nota: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinofilo-carenti (ΔdblGATA, sfondo BALB/c) e delle cellule T γδ-carenti (TCRδ-/-, sfondo B6) topi sono stati usati per questo studio. Per ogni esperimento, età e genere-abbinato topi (sia maschi che femmine) sono stati usati per ogni gruppo. Impoveriscono neutrofili via (IP) iniezione intraperitoneale dell’anticorpo di anti-mouse-Ly – 6G di 0,1 mL (0,5 mg) in soluzione fisiologica sterile a 45° nel quadrante destro inferiore laterale (per un programma sperimentale, Vedi Figura 2). 24 ore più tardi, infettare topi dall’aspirazione con 5,0 x 106a. fumigatus conidi sospesi in 50 soluzione salina sterile µ l (vedere i passaggi 2.4-2.10) come descritto in precedenza11. Dopo l’infezione, iniettare un sottoinsieme degli animali con agente antimicotico come diacetato di caspofungin 5 mg/kg in DPBS utilizzato in questo studio (tutti i giorni, Vedi Figura 2). Anestetizzare topi con isoflurano 99,9% utilizzando una macchina di anestesia veterinaria. Posizionare un tovagliolo di carta sul pavimento della camera ad induzione per catturare le feci e nelle urine. Posizionare il mouse nella camera di induzione, avvitare il coperchio e impostare il vaporizzatore per isoflurano 5% per 2 min e 30 s.Nota: Unguento veterinario non viene utilizzato perché il tempo totale in anestesia è meno di 5 min. Ridurre il vaporizzatore a metà l’impostazione massima per 30 s. Confermare che il mouse è adeguatamente anestetizzato osservando rallentato la respirazione, mancanza di movimento e la mancanza di risposta allo stimolo di punta-pizzico. Rimuovere il mouse dall’aula di induzione e posto su un asse inclinato. Posizionare il mouse con le spalle contro il bordo. Assicurarsi che i suoi incisivi superiori sono delicatamente trattenuti con un elastico e gli incisivi inferiori sono delicatamente trattenuti con un filo metallico. Tenere attentamente la lingua alla massima estensione con piccole pinze e dispensare 50 µ l della sospensione di conidi/PBS alla base della linguetta. Tieni a freno la lingua alla massima estensione; Ascolta per respirazione rapida e il distinto rumore di aspirazione. Tenere premuto per 20 s o fino a quando la sospensione è completamente aspirato. Rimuovere il mouse dal bordo inclinato e posizionare con delicatezza in una gabbia per l’osservazione. A seguito di aspirazione, il mouse dovrebbe riprendere coscienza entro 1 min Monitor mouse finché non pienamente cosciente e in grado di camminare intorno alla gabbia. Gli animali dovrebbero essere ospitati a 21 ° C e controllati due volte al giorno fino a che i polmoni sono raccolte. Ripetere l’esaurimento dei neutrofili (punto 2.2) 24h post-infettiva (Figura 2). Figura 2: pianificazione sperimentale. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione8. 3. raccolta e conservazione dei polmoni di Mouse per analisi istologica Profondamente anestetizzare l’animale con una dose fatale di 0,1 ml di 390 mg/ml sodio pentobarbital soluzione IP. Confermare l’eutanasia osservando la mancanza di respirazione spontanea e l’assenza di risposta alla stimolazione degli arti con le pinzette. Una volta che l’eutanasia, spruzzare la carcassa con etanolo al 70% per sterilizzare. Posto la carcassa su un bordo della gomma piuma è ricoperta da un tampone assorbente.Nota: La carcassa deve essere inserita sul dorso con perni fissaggio tutte e quattro le membra per il bordo della gomma piuma. Aprire la cavità di cassa superiore utilizzando le forbici con cautela. Tagliare via la gabbia toracica al fine di esporre i polmoni e il cuore. Tagliare la vena cava inferiore per consentire per aspersione. Evitare i vasi sanguigni di taglio e perforazione di organi. Irrorare lentamente con 5 mL di DPBS freddo nel ventricolo destro del cuore ad un angolo di 45° con un ago da 25-G. Ripetere la perfusione con 5 mL di formalina al 10%. Attentamente esporre la trachea e staccare i cuscinetti di grasso circostanti. Prestare attenzione ed evitare di perforare la trachea. Assicurarsi che il tessuto connettivo in eccesso viene rimosso al fine di visualizzare completamente la trachea prima di procedere. Una volta che la trachea è esposto, collocare la pinza sotto la trachea per elevarlo. Colpire un piccolo foro nella trachea superiore utilizzando un ago 25-G.Nota: Il foro deve essere posizionato in modo che la cannula intera si inserisce nella trachea. Usare cautela per evitare la rottura della trachea. Inserire una cannula attraverso il foro e verso i polmoni. Fissare la cannula con un filo chirurgico legato senza bloccare intorno alla trachea.Nota: Se si rompe la trachea, la cannula può essere inserita passato la trachea per quanto possibile nelle vie respiratorie. Usando una siringa, gonfiare i polmoni con 1 mL di tampone di formalina 10% attraverso la cannula. Assicurarsi che l’inflazione dei polmoni è visibile. In caso contrario, regolare il catetere e ripetere. Una volta che i polmoni sono gonfiati, rapidamente rimuovere la cannula con cautela e stringere il filo in modo sicuro per sigillare la trachea.Nota: Se la trachea è rotto e non possono essere gonfiati i polmoni, i polmoni possono ancora essere raccolti ma questo potrebbe impedire il corretto fissaggio. Rimuovere delicatamente la trachea e i polmoni dal petto staccando accuratamente il tessuto connettivo della trachea con il forcipe tirando delicatamente sul thread. Posizionare i polmoni e la trachea in una provetta conica da 50 mL con 15 mL di buffer di formalina 10%. Inserire un’estremità del filo esterno del tubo e il tappo di tenuta. Capovolgere la provetta per immergere completamente il campione nel fissativo. Conservare i campioni a temperatura ambiente per almeno 24 ore o fino a ulteriore elaborazione.Attenzione: La formalina è pericolosa. Indossare adeguati dispositivi di protezione personali compresi occhiali e mascherina facciale. Lavorare sotto una cappa chimica durante l’elaborazione di campioni. 4. raccolta e conservazione dei polmoni di Mouse per DNA fungine onere Seguire i passaggi 3.1-3.5 come descritto in precedenza su un mouse separato. Irrorare lentamente con 10 mL di DPBS freddo nel ventricolo destro del cuore ad un angolo di 45° con un ago da 25-G. Asportare i polmoni con le forbici e posto in provette da 1,5 mL con etichetta. Memorizzare i polmoni a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Utilizzare le tecniche standard come descritto (incorporamento e sezionamento) e secondo i protocolli del produttore (Vedi Tabella materiali). 5. microscopia e Imaging Aprire il programma imaging di quantificazione (Vedi Tabella materiali). Utilizzando un microscopio ottico, ottenere almeno 4 campi distinti di GMS (obiettivo 10x) vetrini colorati. Garantire che le immagini sono rappresentative delle vie aeree all’interno del polmone con simile densità del tessuto infettate.Nota: Se la densità e la distribuzione dei fuochi ifali appaiono marcatamente differenti fra gruppi sperimentali e di controllo, campi aggiuntivi possono essere adottate, o l’area di GMS della sezione intero polmone può essere imaged (obiettivo 4x). Ottenere immagini delle stesse zone del polmone (identificato dalla morfologia del tessuto equivalente) su una sezione di polmone seriale colorati con ematossilina ed eosina, se lo si desidera. Aggiungere barre di scala per le immagini, ove necessario e salvare le immagini da quantificare. Selezionate, modifica > Aggiungi/modifica taratura marchi > Menu: Scegli la dimensione barra di spessore, colore e scala di riga > Clicca sull’immagine per la quale la barra della scala deve essere messo. Chiudere il Menu e scegliete, modifica > Merge > Merge calibrazione marchi > scegliere Salva con nome > nome del file e fare clic su Salva. 6. utilizzando un programma di elaborazione immagini per calcolare l’onere fungina (Figura 3) Aprire un programma di elaborazione di immagini. Selezionare File > cartella con campioni di quantificare > immagine (Figura 3A). Selezionare immagine > tipo > convertire “RGB stack” (Figura 3B). Utilizzare il tasto freccia destra per selezionare la seconda delle tre immagini data (Figura 3B). Premere “CTRL + MAIUSC + T” per far apparire il flusso di “Soglia” dal menu impostazioni (Figura 3). Individuare l’immagine TIFF o jpg originale come riferimento e aprire con una programma (Figura 3) la visualizzazione di immagini. Tirare il cursore in alto a sinistra e regolare il dispositivo di scorrimento inferiore fino a quando l’area selezionata (in rosso) è rappresentativo dell’immagine di microscopia (in genere che vanno da 130-160 come indicato a destra del dispositivo di scorrimento (Figura 3). Una volta selezionato, premere il tasto “Set” > “OK” (Figura 3D). Selezionare “Analizza” > “Impostare misure” > Verifica “Area, frazione di zona, limite di soglia, etichetta visualizzata” e lasciare le impostazioni di fondo (il menu a discesa e decimali) come predefinito > “OK” (Figura 3D). Aree significative di spazi vuoti o una colorazione di fondo possono essere esclusi dalla selezione del tessuto appropriato con uno strumento di area o poligono. Infine seleziona, “Analizza” > “Misura” (dovrebbe apparire una finestra con i dati, o verrà visualizzata una scheda della barra delle applicazioni di windows con l’etichetta, “Risultati”) (Figura 3E). Trasferire i dati ad un programma di analisi di dati per grafici e analisi statistica. Inserire la media delle percentuali di quattro area per ogni campione del polmone. 5-8 campioni sono generalmente sufficienti per rilevare differenze significative tra i gruppi. Se si confrontano due gruppi sperimentali, eseguire un spaiata dello studente t-test per determinare il significato. Figura 3: quantificazione di campo rappresentante screenshots per ogni passaggio di GMS istologico. (A) selezionare File > cartella con campioni di quantificare > Seleziona immagine. (B) selezionare immagine > tipo > convertire “RGB stack”. Utilizzare il tasto freccia destra per selezionare la seconda delle tre immagini specificate. (C) Hit “CTRL + MAIUSC + T” per far apparire il flusso di “Soglia” dal menu impostazioni. Individuare l’immagine TIFF o jpg originale come riferimento e aprire con il programma Visualizzatore di foto. Tirare il cursore in alto tutta la strada a sinistra e regolare il dispositivo di scorrimento inferiore fino a quando l’area selezionata (in rosso) è rappresentativo dell’immagine di microscopia (in genere che vanno da 130-160 come indicato a destra del cursore. (D) una volta selezionato premere il tasto “Set” > “OK”. Selezionare “Analizza” > “Impostare misure” > Verifica “Area, frazione di zona, limite di soglia, etichetta visualizzata” e lasciare le impostazioni di fondo (il menu a discesa e decimali) come predefinito > “OK”. (E), infine seleziona “analizza” > “Misura” (dovrebbe apparire una finestra con i dati, o verrà visualizzata una scheda della barra delle applicazioni di windows con l’etichetta “Risultati”). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 7. DNA fungine onere Rimuovere i polmoni da-80 ° C e lyophilize per almeno 4 ore (durante la notte è ottimale) o fino a quando non completamente asciugato da un sistema a secco di congelare. Mentre i polmoni stanno asciugando, preparare il tampone di estrazione del DNA (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0 e 0,5% SDS). Posizionare il tampone di estrazione del DNA preparato in bagnomaria a 60 ° C per pre-riscaldare. Inoltre, posto il fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) in una provetta conica da 50 mL e consentire per la separazione. Collocare i polmoni liofilizzati in una provetta 2 mL tappo a vite con 0,2 mL di perline di vetro. Utilizzando un battitore di perlina, macinare il tessuto polmonare asciutto per 15-30 s fino a formare una polvere fine. Aggiungere 0,8 mL di tampone di estrazione del DNA caldo per ogni provetta e agitare bene. Incubare ogni tubo per 15 min in un bagno di perlina di 65 ° C e poi vortice prima incubazione per altri 15 minuti. Dopo incubazione, vortice e poi Centrifugare le provette a 25.000 x g per 10 min. Etichetta 3 set di provette da 1,5 mL per ciascuno dei campioni e trasferire lo strato superiore del surnatante in un unico set di tubi. Usare cautela durante il pipettaggio fuori lo strato acquoso superiore per non disturbare lo strato intermedio. Aggiungere volume uguale del fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e mescolare bene. Poi Centrifugare a 25.000 x g per 15 min prima di dispensazione fuori lo strato superiore nella seconda serie di tubi. Aggiungere un volume equivalente di cloroformio: isoamyl cloroformio, mescolare bene e centrifugare a 25.000 x g per 10 min attentamente pipetta fuori lo strato superiore nel terzo set di tubi. Aggiungere 500 µ l di isopropanolo e 50 µ l NaoAc (pH 5.2), mescolare bene e lasciare i campioni per incubare a temperatura ambiente per 10 min. Poi Centrifugare a 25.000 x g per 30 min e decantare il supernatante. Lavare il pellet di DNA con 750 µ l di etanolo 70% freddo di ghiaccio e centrifugare per 5 min a 25.000 x g. decantare l’etanolo e lasciare che asciugare il pellet all’aria nei tubi in un cappe per 40 min. Risospendere il pellet asciutto in 300 µ l di buffer di TE.Nota: Il DNA può essere conservato a-20 ° C fino a quando non quantificato. Quantificazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro e preparare 100 µ l di 0,2 µ g / µ l di ciascun campione di DNA per l’analisi qPCR. Eseguire un qPCR standard in triplice copia come precedentemente descritto con 1 µ g di campione di DNA, primer di rDNA 18S fungine, e sonda imposta con un quencher modificate sonda (5′- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/GCA CCC AAT G/3IABkFQ-3’)12,13. Preparare una curva standard da DNA genomic a. fumigatus e calcolare la concentrazione di DNA fungoso in pg in ogni campione utilizzando la media reporter tinta i valori Ct. Tracciare il pg / µ g di DNA fungoso con errore standard della media. Esecuzione di uno studente t-analisi per determinare il significato del test.Nota: come un meno tossico alternativa per l’estrazione di DNA fenolo-cloroformio utilizzato nel presente documento, colonna basato estrazione del DNA kit possono essere utilizzati.