כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של אינדיאנה סטייט, הקמפוס המארח של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה – הוט. 1. הכנת fumigatus א Conidia על זיהום בעת העבודה בברדס fume מאוורר היטב, להוסיף µL 125 של פתרון מניות fumigatus א 293 900 µL תא תרבות כיתה מים (CCGW). ואז להעביר את הפתרון תמצית צלחת אגר (מאה) באמצעות פיפטה מה תשתה, אדוני, נמרח בקלות עם לולאה לחסן. אחסן את הצלחת פטרייתי בחושך ב 24 מעלות צלזיוס לפחות 14 ימים ולא יותר מ- 28 ימים. Conidia הקציר באמצעות חרוזי זכוכית כאמור תיאר9. שופכים 1.5 גר’ 0.5 מ מ חרוזי זכוכית לצלחת, בעדינות להטות את זה אחורה וקדימה עד החרוזים הם מצופה כדי לחלץ conidia. לאסוף את התערובת חרוז/conidia צינור חרוטי 15-mL. להשעות של Dulbecco מ ל תמיסת מלח באגירה פוספט (DPBS) ו מערבולת. לספור את conidia ב 50 x לדילול תגובת שיקוע ב DPBS באמצעות hemocytometer. לספור את מספר conidia באזור המוצג באיור 1 ולהשתמש משוואה 1 כדי לחשב את הריכוז.גורם לדילול × #Conidia × 104= Conidia/mL (משוואה 1)הערה: שטחים נוספים של פינה מרובעת 4 x 4 יכול לספור עם הממוצע של אזורים אלה משמשים #Conidia משוואה1. איור 1: Hemocytometer נציג שטח המשמש conidia סומך (תיבת, חץ). לדלל את המתלים conidia עם סליין סטרילי (DPBS) כדי לקבל את הריכוז הרצויה, 1.0 x 108 conidia/mL עבור זיהום עם 5 x 106 conidia/50 µL. להכין 50 µL ‘ של conidia פתרון לכל ‘ n + 2’ עכברים נגועה לחשבון עבור pipetting שגיאה.הערה: קציר פטריות רגיל ולסינון/הכנה ייתכן לחלופין בשימוש10. השיטה חרוז זכוכית מומלץ להשתמש כדי להבטיח כי דגימות conidia עם אנטיגנים hyphal קטן/מסיסים מינימלי מתקבלים עבור השאיפה. 2. החיסוני, זיהום של המודל מאתר השתמש 7-10-בת שבוע עכברים.הערה: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil לקויה (ΔdblGATA, רקע BALB/c), γδ תא T לקויה (TCRδ-/-, רקע B6) עכברים השתמשו במחקר זה. עבור כל ניסוי, גיל, התאימו מגדר עכברים (זכרים ונקבות) שימשו עבור כל קבוצה. לרוקן נויטרופילים ויה בקרום הבטן (IP) הזרקה של 0.1 מ”ל (0.5 מ ג) נוגדן אנטי-mouse-Ly – 6G במלח סטרילית-45° ברביע התחתון הנכון לרוחב (עבור לוח זמנים של ניסיוני, ראה איור 2). 24 שעות לאחר מכן, להדביק עכברים על ידי השאיפה עם 5.0 x 10 conidiafumigatus א 6, הושעו ב-50 µL מלח סטרילית (ראה שלבים 2.4-2.10) כאמור תיאר11. בעקבות זיהום, להזריק תת-ערכה של חיות עם סוכן פטריות כגון diacetate קספופונגין 5 מ”ג/ק”ג ב DPBS השתמשו במחקר זה (מדי יום, ראה איור 2). עזים ומתנגד עכברים עם איזופלוריין 99.9% באמצעות מכונת הרדמה וטרינרי. מניחים מגבת נייר על הרצפה של החדר אינדוקציה לתפוס צואה ושתן. הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה, לאבטח את המכסה והגדר את מכשיר אידוי לאיזופלוריין 5% עבור 2 דקות ו- 30 s.הערה: משחה הוטרינר אינו משמש כי הזמן הכולל תחת הרדמה היא פחות מ- 5 דקות. להפחית את מכשיר אידוי חצי בהגדרה המרבית עבור 30 s. לאשר העכבר הוא מורדם כראוי על ידי התבוננות האטה, חוסר תנועה ונשימה חוסר תגובה לגירוי הבוהן-קורט. הסר את העכבר לשכת הגיוס והמקום על לוח שיפוע. הנח את העכבר עם גבו מול הלוח. ודא החותכות העליונות שלה בעדינות מאופקים עם גומייה החותכות התחתון בעדינות מאופקים עם חוט מתכת. בזהירות להחזיק את הלשון מלאה עם מלקחיים קטנים, פיפטה µL 50 conidia/PBS השעיה בבסיס הלשון. . נצור את לשונך על שלוחה מלא; הקשיבו נשימה מהירה, רעש הנקישה ברורים של השאיפה. להחזיק 20 s או עד ההשעיה היא aspirated באופן מלא. להסיר את העכבר מהלוח שיפוע ומניחים בעדינות בתוך כלוב להשגחה. בעקבות שאיפה, העכבר צריך להכרה בתוך 1 מינימלית צג העכבר עד בהכרה מלאה, מסוגל ללכת מסביב לכלוב. צריך להיות מאילן 21 ° C, במעקב פעמיים ביום עד הריאות נקצרים החיות. חזור על דלדול של נויטרופילים (שלב 2.2) 24 שעות לאחר הפגיעה (איור 2). איור 2: לוח הזמנים ניסיוני. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. 3. הקציר ושימור של הריאות העכבר לבדיקה היסטולוגית עמוק עזים ומתנגד החיה עם מנה קטלנית של 0.1 מ”ל של 390 מ”ג/מ”ל סודיום פנטוברביטל פתרון IP. לאשר המתת חסד על ידי התבוננות חוסר נשימה ספונטנית, היעדר תגובה גירוי איבר עם פינצטה. ברגע מורדמים, לרסס את הגווייה עם 70% אתנול לחטא. מקם את הגווייה על לוח מוקצף מכוסה רכיב pad סופג.הערה: הגווייה יוצבו על גבו עם סיכות אבטחת כל ארבעת הגפיים ללוח קצף. פתח את החזה העליון באמצעות מספריים בזהירות. לחתוך את כלוב הצלעות על מנת לחשוף את הריאות והלב. חותכים הכלילי התחתון כדי לאפשר זלוף. להימנע חיתוך כלי הדם ניקב את האיברים. לאט לאט perfuse עם 5 מ של DPBS קר בתוך החדר הימני של הלב בזווית של 45 מעלות עם מחט 25-G. חזור על זלוף 5 מ של 10% פורמלין. בזהירות לחשוף את קנה הנשימה ולנתק את רפידות השומן שמסביב. משנה זהירות ולהימנע ניקב את קנה הנשימה. ודא שרקמת חיבור עודף מוסר כדי להמחיש באופן מלא קנה הנשימה לפני שתמשיך. ברגע קנה הנשימה חשוף, במקום מלקחיים תחת קנה הנשימה להעלות את זה. לעשות חור קטן קנה הנשימה העליונות באמצעות מחט 25-G.הערה: החור צריך למקם כך הצינורית כולו מתאים לקנה. . בזהירות כדי למנוע קריעה קנה הנשימה. הכנס בצינורית דרך החור, לכיוון הריאות. אבטח את הצינורית עם חוט כירורגי קשור באופן רופף סביב קנה הנשימה.הערה: אם קנה הנשימה קרוע, ניתן למקמם את הצינורית דרך קנה הנשימה ככל האפשר דרכי הנשימה. באמצעות מזרק, מנפח הריאות עם 1 מ ל 10% מאגר פורמלין דרך הצינורית. ודא כי האינפלציה של הריאות הוא גלוי. אם לא, להתאים את הצנתר וחזור. ברגע הריאות הם מנופח, להסיר את הצינורית בזהירות ובמהירות להדק את החוט בצורה מאובטחת לאטום את קנה הנשימה.הערה: אם קנה הנשימה הוא נקרע, לא יכול לנפח את הריאות, עדיין עשויים להיות שנקטפו הריאות, אך הדבר עלול למנוע קיבוע נאות. הסר בעדינות את קנה הנשימה והריאות מבית החזה על ידי בקפידה ניתוק רקמת החיבור של קנה הנשימה עם מלקחיים תוך משיכת בעדינות החוט. הכנס צינור חרוטי 50-mL 15 מ ל 10% פורמלין מאגר בריאות, קנה הנשימה. מקם קצה אחד של החוט מחוץ הצינור, לאטום את הכובע. היפוך צינור כדי לגמרי להטביע את הדגימה לשבועיים. אחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות או עד עיבוד נוסף.התראה: פורמלין הוא דבר מסוכן ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כולל משקפי מגן, מסיכת פנים. לעבוד תחת ברדס כימי בעת עיבוד הדגימות. 4. הקציר ושימור של הריאות העכבר עבור נטל פטרייתי דנ א בצע את שלבים 3.1-3.5 כפי שתואר לעיל על עכבר נפרד. לאט לאט perfuse עם 10 מ”ל של DPBS קר בתוך החדר הימני של הלב בזווית של 45 מעלות עם מחט 25-G. לסלק את הריאות עם מספריים ולמקם mL 1.5 שכותרתו צינורות. לאחסן את הריאות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף. להשתמש בטכניקות סטנדרטי כמתואר (הטבעה ואת חלוקתה) ועל פי הפרוטוקולים של היצרן (ראה טבלה של חומרים). 5. מיקרוסקופ והדמיה פתח את התוכנית כימות הדמיה (ראה טבלה של חומרים). באמצעות מיקרוסקופ אור, להשיג לפחות 4 תחומי ברורים סקאוטרים צבעונית שקופיות (המטרה X 10). להבטיח שתמונות נציג של דרכי הנשימה נגועים בתוך הריאה עם צפיפות רקמה דומה.הערה: אם צפיפות, התפלגות של מוקדים hyphal מופיעים שונה במידה ניכרת בין קבוצות ניסוי ובקרה, שדות נוספים עשוי להילקח, או האזור סקאוטרים של המקטע כל הריאה ייתכן לדימות (4 X המטרה). להשיג כמה תמונות של האזורים של הריאות (המזוהה על-ידי רקמות המקביל מורפולוגיה) על מקטע ריאות טורי מוכתם hematoxylin ואאוזין, אם רצונך בכך. להוסיף קווי מידה לתמונות במידת הצורך ולשמור את התמונות כדי ניתן לכמת. בחירה, עריכה > הוסף/ערוך כיול סימני > תפריט: בחר גודל בר עובי, צבע, מידה קו > לחצו על התמונה עבור איפה סרגל קנה מידה כדי למקם. סגירת התפריט ולבחור, עריכה > מיזוג > למזג סימנים כיול > לבחור קובץ שמירה בשם > שם לקובץ ולאחר מכן לחץ על שמור. 6. שימוש את תוכנית עיבוד התמונה כדי לחשב את הנטל פטרייתיים (איור 3) פתח את תוכנית עיבוד תמונה. בחר קובץ > תיקיה עם דגימות לכמת > תמונה (איור 3 א). בחר את התמונה > סוג > להמיר ל- “RGB מחסנית” (איור 3B). השתמש במקש חץ ימינה כדי לבחור השני של שלוש תמונות נתון (איור 3B). פגע “control + shift + T” להעלות את “סף” תפריט הגדרות ומתאם (איור 3C). אתר את התמונה המקורית של .tiff או. jpg כהפניה ופתח עם תמונה הצגת התוכנית (איור 3C). משוך את המחוון למעלה עד הסוף שמאלה, התאם את המחוון התחתון עד האזור שנבחר (באדום) הוא נציג של תמונת מיקרוסקופ (בדרך כלל החל מ- 130-160 כמצוין שבצד המחוון (איור 3C). ברגע שנבחר, הקש על “קבע” > “אישור” (דמות תלת-ממד). בחר ‘נתח’ > “הגדרת המידות” > בדוק “אזור, אזור השבר, הגבלה על הסף, הצג תווית” ולהשאיר את ההגדרות התחתון (את התפריט הנפתח ואת העשרונית) כברירת מחדל > “אישור” (דמות תלת-ממד). אזורים משמעותי של רווח לבן או צביעת הרקע אולי ייכללו לפי בחירה של הרקמה המתאימה עם כלי שטח או מצולע. לבסוף לבחור, “נתח” > “מדידה” (יופיע חלון עם נתונים או כרטיסיה בשורת המשימות של windows יופיע בתווית, “תוצאות”) (איור 3E). להעביר את המידע תוכנית ניתוח נתונים עבור יצירת גרפים וניתוח סטטיסטי. הזן הממוצע של האחוזים אזור ארבע עבור כל דגימה ריאות. 5-8 דגימות הן בדרך כלל מספקות לזהות הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. אם השוואה בין שתי קבוצות הניסוי, לבצע של סטודנט אינטראקצית t-מבחן כדי לקבוע מובהקות. איור 3: נציג צילומי מסך עבור כל שלב של סקאוטרים היסטולוגית שדה כמת. (א) בחר קובץ > תיקיה עם דגימות לכמת > בחר תמונה. (B) בחר תמונה > סוג > להמיר ל- “RGB מחסנית”. השתמש במקש חץ ימינה כדי לבחור השני של שלוש תמונות נתון. (ג) להיט “control + shift + T” להעלות את “סף” תפריט הגדרות ומתאם. אתר את התמונה המקורית של .tiff או. jpg כהפניה ופתח בתוכנית מציג תמונה. משוך את המחוון למעלה כל הדרך שמאלה, התאם את המחוון התחתון עד האזור שנבחר (באדום) הוא נציג של תמונת מיקרוסקופ (בדרך כלל החל מ- 130-160 כמצוין שבצד המחוון. (ד) לאחר מסומנת לחץ “קבע” > “אישור”. בחר ‘נתח’ > “הגדרת המידות” > בדוק “אזור, אזור השבר, הגבלה על הסף, הצג תווית” ולהשאיר את ההגדרות התחתון (את התפריט הנפתח ואת העשרונית) כברירת מחדל > “אישור”. (E) ולבסוף בחר “נתח” > “מדידה” (יופיע חלון עם נתונים או כרטיסיה בשורת המשימות של windows יופיע שכותרתו “תוצאות”). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 7. דנ א נטל פטרייתי הסר את הריאות-80 ° C ולאחר lyophilize במשך 4 שעות לפחות (בן לילה הוא אופטימלי) או עד יבש לחלוטין על-ידי מערכת ההקפאה יבש. בעוד הריאות הם ייבוש, להכין מאגר של הפקת דנ א (0.1 M NaCl, 10 מ מ EDTA pH 8.0, 10 מ מ טריס HCl pH 8.0, ו- 0.5% מרחביות). מקום המאגר מיצוי הדנ א מוכן באמבט מים 60 ° C כדי לחמם. בנוסף, המקום פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:24:1) צינור חרוטי 50-mL ולאפשר הפרדה. מקם את הריאות lyophilized צינור 2-mL בורג מכסה 0.2 מ של חרוזי זכוכית. באמצעות מכה חרוז, לטחון את רקמת הריאה יבש עבור s 15-30 עד להיווצרות אבקה. להוסיף מאגר ה-DNA החילוץ חמים 0.8 מ ל כל שפופרת של מערבולת היטב. דגירה כל שפופרת למשך 15 דקות אמבט חרוז 65 ° C, ואז מערבולת לפני המקננת למשך 15 דקות נוספות. לאחר המקננת, מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה צינורות ב g 25,000 x למשך 10 דקות. תווית 3 זוגות 1.5 mL צינורות לכל אחת הדגימות ולהעביר את השכבה העליונה של תגובת שיקוע לתוך מערכת אחת של צינורות. שימוש באזהרה בעת pipetting את השכבה העליונה מימית כדי שלא להפריע למטופלים השכבה האמצעית. להוסיף נפח שווה של אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl ומערבבים היטב. ואז צנטריפוגה ב g x 25,000 למשך 15 דקות לפני pipetting את השכבה העליונה לתוך הסט השני של צינורות. להוסיף נפח שווה של כלורופורם: isoamyl כלורופורם, מערבבים היטב, צנטריפוגה-g x 25,000 עבור 10 דקות פיפטה בקפידה את השכבה העליונה לתוך סדרה של צינורות. להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל 50 µL NaoAc (pH 5.2), מערבבים היטב, ומאפשרים דגימות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. צנטריפוגה ואז ב g x 25,000 למשך 30 דקות, decant את תגובת שיקוע. לשטוף בגדר DNA עם 750 µL של אתנול 70% קר קרח, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 25,000 ג’י Decant האתנול ולאפשר שכדורי לאוויר יבש את החצוצרות שלה ב ציטוטוקסיקה למשך 40 דקות. Resuspend כדורי יבש ב- 300 µL טה המאגר.הערה: ה-DNA ניתן לאחסן ב-20 ° C עד לכמת. לכמת הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהכין µL 100 של 0.2 µg µL של כל מדגם ה-DNA לניתוח qPCR. לבצע qPCR סטנדרטי שהפקידים שתואר קודם לכן גם עם µg 1 של דנ א, פריימר rDNA 18S פטרייתי, ומגדיר בדיקה עם כ’חטיף בדיקה שונה (5′- / 56-FAM/אילנה CGG חטיבתי/זן/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ‘)12,13. להכין עיקול רגיל של הדנ א fumigatus א , לחשב את ריכוז הדנ א פטרייתי ב pg בכל דגימה באמצעות הכתב הממוצע לצבוע Ct ערכים. להתוות את pg/µg של ה-DNA פטריות עם שגיאת התקן של הממוצע. ביצוע של תלמיד t-מבחן ניתוח כדי לקבוע מובהקות.הערה: כפי פחות רעיל אלטרנטיבה הפקת דנ א פנול-כלורופורם המשמשות בתקנון, עמודה מבוסס DNA מיצוי ערכות יכול לשמש.