Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

Alle tierische Verfahren wurden genehmigt durch das Animal Care und Nutzung Ausschuss der Indiana State University, die Host-Campus der Indiana University School of Medicine – Terre Haute. 1. Vorbereitung von A. Fumigatus Konidien auf Infektion Während der Arbeit in einem gut gelüfteten Abzug, fügen Sie 125 µL der Stammlösung A. Fumigatus 293 900 µL Kultur Grade Zellwasser (CCGW hinzu). Übertragen Sie dann die Lösung Malz-Extrakt (MEA) Nährbodenplatte per Pipette und gleichmäßig mit einer Impfkeimen Schleife. Speichern Sie die Pilze Platte im Dunkeln bei 24 ° C für mindestens 14 Tage und nicht mehr als 28 Tage. Ernten Sie mit Glasperlen als zuvor beschriebenen9Konidien. Gießen Sie 1,5 g 0,5 mm Glasperlen auf den Teller und neigen Sie ihn sanft hin und her bis die Perlen beschichtet sind, um Konidien zu extrahieren. Die Perle/Konidien Mischung in einem 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Aussetzen Sie in 5 mL Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und Wirbel. Zählen Sie die Konidien in ein 50 X Verdünnung der Überstand in DPBS mit einer Hemocytometer. Die Anzahl der Konidien im Bereich in Abbildung 1 dargestellte und Gleichung 1 verwenden, um die Konzentration zu berechnen.#Conidia × Verdünnung Faktor 10 ×4= Konidien/mL (Gleichung 1)Hinweis: Zusätzliche 4 x 4 Quadrat Eckbereichen können, mit dem Mittelwert dieser Bereiche als #Conidia in Gleichung 1angerechnet werden. Abbildung 1: Hemocytometer repräsentativen Bereichs verwendet für Konidien zählen (Box, Pfeil). Verdünnen Sie die Konidien Aussetzung mit steriler Kochsalzlösung (DPBS) um die gewünschte Konzentration, 1.0 x 108 Konidien/mL für eine Infektion mit 5 x 106 Konidien/50 µL. bereiten 50 µL Konidien Lösung zu erhalten pro ‘n + 2′ Mäuse entfallen Pipettieren ansteckungsverdächtigen Fehler.Hinweis: Standard Pilz Ernte und Vorbereitung/Filtration können alternativ verwendeten10sein. Die Glas-Wulst-Methode eignet sich besonders dazu bei, dass Konidien Proben mit minimal kleinen/löslichen Bodenaggregaten Antigene für Aspiration gewonnen werden. (2) Immunsuppression und Infektion von Mausmodell 7-10-Wochen alten Mäusen zu verwenden.Hinweis: BALB/c, C57BL/6 (B6), Eosinophilen-defizienten (ΔdblGATA, BALB/c-Hintergrund) und γδ T-Zell-Mangel (TCRδ-/-, B6-Hintergrund) Mäuse wurden für diese Studie verwendet. Für jedes experiment, Alter und Geschlecht angepasst wurden (Männchen und Weibchen) Mäuse für jede Gruppe verwendet. Neutrophilen Granulozyten über intraperitoneale (IP) Injektion von 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly – 6G Antikörper in steriler Kochsalzlösung bei 45° in den seitlichen unteren rechten Quadranten zu einem Abbau (für einen experimentellen Terminplan, siehe Abbildung 2). 24 h später, infizieren Mäuse durch Absaugen mit 5,0 x 106A. Fumigatus Konidien ausgesetzt in 50 µL steriler Salzlösung (siehe Schritte 2.4-2.10) wie oben beschrieben11. Nach Infektion, eine Teilmenge von Tieren mit Antimykotikum z. B. 5 mg/kg Caspofungin Diacetat in DPBS in dieser Studie verwendeten injizieren (täglich, siehe Abbildung 2). Mäuse mit 99,9 % Isofluran Verwendung eine tierärztliche Anästhesiegerät zu betäuben. Legen Sie ein Papiertuch auf den Boden der Kammer Induktion, Kot und Urin zu fangen. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Induktion-Kammer, sichern den Deckel und legen Sie den Verdampfer auf 5 % Isofluran für 2 min und 30 s.Hinweis: Vet-Salbe wird nicht verwendet, weil die Gesamtzeit unter Narkose weniger als 5 Minuten ist. Reduzieren den Vaporizer auf die Hälfte der maximalen Einstellung für 30 s. Bestätigen, dass die Maus durch die Beobachtung richtig betäubt wird verlangsamt, Atmung, Mangel an Bewegung und mangelnde Reaktion auf Zehe-Prise Reiz. Entfernen Sie die Maus aus der Induktion Kammer und auf einem Brett schräg. Platzieren Sie die Maus mit dem Rücken gegen das Brett. Stellen Sie sicher, dass die oberen Schneidezähne sanft mit einem Gummiband gesichert sind und die unteren Schneidezähne sind mit einem Metallgitter vorsichtig verhalten. Halten Sie sorgfältig die Zunge bei voller Streckung mit kleinen Zangen und 50 µL Pipette Konidien/PBS-Aufhängung an der Basis der Zunge. Halten Sie die Zunge bei voller Streckung; schnelle Atmung und die ausgeprägte klickendes Geräusch der Aspiration hören. Halten Sie für 20 s oder bis Aussetzung vollständig abgesaugt wird. Entfernen Sie die Maus vom Brett schräg und sanft in einen Käfig für die Beobachtung. Nach Aspiration sollte die Maus wieder zu Bewusstsein innerhalb 1 min. Monitor die Maus bis voll bewusst und in der Lage, um den Käfig zu gehen kommen. Die Tiere sollten bei 21 ° C untergebracht und zweimal täglich überwacht, bis die Lunge geerntet werden. Wiederholen Sie die Erschöpfung der Neutrophilen (Schritt 2.2) 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2). Abbildung 2: experimentelle Zeitplan. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. 3. die Ernte und die Erhaltung der Maus Lungen für histologische Analyse Das Tier mit einer tödlichen Dosis von 0,1 ml 390 mg/ml Natrium Pentobarbital Lösung IP tief zu betäuben. Bestätigen Sie Euthanasie durch die fehlende Spontanatmung und keine Antwort erhalten, Leib Stimulierung mit einer Pinzette Beobachtung. Sobald eingeschläfert, sprühen Sie die Karkasse mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Legen Sie den Kadaver auf eine Dämmplatte mit einem Saugkissen bedeckt.Hinweis: Die Karkasse sollte auf dem Rücken mit Stecknadeln sichern alle vier Gliedmaßen zu Dämmplatte platziert werden. Öffnen Sie den oberen Brustraum mit einer Schere vorsichtig. Um die Lunge und das Herz aussetzen schneiden Sie des Brustkorbs Weg. Schneiden der minderwertigen Vena Cava, um Durchblutung zu ermöglichen. Schneiden die Blutgefäße und Punktion der Organe zu vermeiden. Durchspülen Sie langsam mit 5 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel. Wiederholen Sie die Perfusion mit 5 mL der 10 % Formalin. Vorsichtig aussetzen der Luftröhre und der umgebenden Fettpolster zu lösen. Seien Sie vorsichtig und vermeiden Sie Punktion der Trachea. Stellen Sie sicher, dass überschüssige Bindegewebe entfernt wird, um die Luftröhre, bevor Sie fortfahren vollständig sichtbar zu machen. Sobald die Luftröhre ausgesetzt ist, legen Sie Zange unter der Luftröhre, es zu erheben. Stechen Sie ein kleines Loch in der oberen Luftröhre mit einer 25-G-Nadel.Hinweis: Das Loch sollte positioniert werden, so dass die gesamte Kanüle in der Luftröhre passt. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, bersten die Luftröhre. Legen Sie eine Kanüle durch das Loch und in Richtung der Lungen. Sichern Sie die Kanüle mit einem chirurgischen Faden locker um die Luftröhre gebunden.Hinweis: Wenn die Luftröhre gerissen ist, kann die Kanüle vorbei an der Luftröhre so weit wie möglich in die Atemwege eingeführt. Mit einer Spritze, Aufblasen der Lunge mit 1 mL 10 % Formalin Puffer durch die Kanüle. Stellen Sie sicher, dass die Inflation der Lunge sichtbar ist. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie den Katheter und wiederholen. Sobald die Lungen aufgeblasen sind, schnell entfernen der Kanüle mit Vorsicht und ziehen Sie den Faden fest an der Luftröhre abzuriegeln.Hinweis: Wenn die Luftröhre gebrochen ist und die Lunge können nicht aufgepumpt werden, die Lunge können noch geerntet werden, aber dies kann verhindern, dass die ordnungsgemäße Fixierung. Entfernen Sie vorsichtig die Luftröhre und Lunge von der Brust durch sorgfältig trennen das Bindegewebe der Trachea mit der Pinzette während sanft auf dem Thread hochziehen. Legen Sie die Lunge und Luftröhre in ein 50 mL konische Röhrchen mit 15 mL 10 % Formalin Puffer. Platzieren Sie ein Ende des Fadens außerhalb der Röhre und verschließen Sie die Kappe. Invertieren Sie das Rohr um völlig eintauchen die Probe in Fixiermittel. Speichern Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 24 h oder bis Weiterverarbeitung.Vorsicht: Formalin ist gefährlich. Geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Schutzbrille und Mundschutz zu tragen. Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube bei der Verarbeitung von Proben. 4. Ernte und Erhaltung der Maus Lungen für DNA-Pilz-Belastung Führen Sie die Schritte 3.1-3.5, wie oben beschrieben, auf eine separate Maus. Durchspülen Sie langsam mit 10 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel. Verbrauchssteuern Sie der Lunge mit einer Schere und in beschrifteten 1,5 mL Röhrchen. Bis zur Weiterverarbeitung lagern Sie der Lunge bei-80 ° C. Verwenden Sie standard-Techniken, wie beschrieben (Einbettung und schneiden) und nach Hersteller Protokolle (siehe Tabelle der Materialien). (5) Mikroskopie und Imaging Öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm Quantifizierung (siehe Tabelle der Materialien). Mit einem Lichtmikroskop, erhalten Sie mindestens 4 verschiedene Felder der GMS gefärbten Folien (10 X Objektiv). Sicherstellen Sie, dass die Bilder für die infizierten Luftwege in der Lunge mit ähnlicher Dichte Gewebe repräsentativ sind.Hinweis: Wenn die Dichte und die Verteilung von Bodenaggregaten Brennpunkte zwischen Steuerung und experimentellen Gruppen deutlich anders aussehen, Zusatzfelder ergriffen werden oder die GMS-Bereich des ganzen Lunge kann abgebildet werden (4 X Objektiv). Erhalten Sie die gleichen Bereiche der Lunge (gekennzeichnet durch gleichwertige Gewebe Morphologie) auf einem seriellen Lunge Abschnitt gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, falls gewünscht. Fügen Sie Maßstabsleisten zu den Bildern hinzu, wenn nötig und speichern Sie die Bilder quantifiziert werden. Auswählen, Bearbeiten > hinzufügen/bearbeiten Kalibrierungsmarkierungen > Menü: Wählen Sie dicke, Farbe und Größe der Bar Nennweite > Klicken Sie auf das Bild für an die Maßstabsleiste platziert werden soll. Schließen Sie das Menü und wählen Sie, Bearbeiten > Zusammenführen > Zusammenführen Kalibrierungsmarkierungen > Datei speichern unter Wählen > benennen Sie die Datei und klicken Sie auf speichern. 6. verwenden ein Bildbearbeitungsprogramm um den Pilz Belastung (Abbildung 3) zu berechnen Öffnen Sie ein Bildbearbeitungsprogramm. Wählen Sie Datei > Ordner mit Proben zu quantifizieren > Bild (Abbildung 3A). Wählen Sie Bild > Art > “RGB-Stack” (Abb. 3 b) umwandeln. Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder (Abb. 3 b) auszuwählen. Drücken Sie “STRG + UMSCHALT + T” zu bringen, die “Schwelle” Menü Einstellungen Einsteller (Abbildung 3). Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und öffnen mit einer Bildanzeige-Programm (Abbildung 3). Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers (Abbildung 3). Einmal ausgewählt, drücken Sie die Taste “Set” > “OK” (Abbildung 3D). Wählen Sie “Analyse” > “Messungen festlegen” > “Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen” prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard > “OK” (Abbildung 3D). Wichtige Bereiche der Leerraum oder Hintergrundfärbung können durch Auswahl des entsprechenden Gewebes mit einem Bereich oder Polygon Tool ausgeschlossen werden. Schließlich wählen Sie “Analyse” > “Measure” (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung, “Ergebnisse”) (Abbildung 3E). Übertragen Sie die Daten auf eine Daten-Analyse-Programm für die grafische Darstellung und statistische Analyse. Geben Sie den Mittelwert aus den vier Bereich Prozentsätze für jede Lunge Probe. 5-8 Proben sind in der Regel ausreichend, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen. Wenn zwei Versuchsgruppen vergleichen, führen Sie ein ungepaartes Student t-Test, um die Bedeutung zu bestimmen. Abbildung 3: Vertreter Screenshots für jeden Schritt des GMS histologischen Feld Quantifizierung. (A) wählen Sie Datei > Ordner mit Proben zu quantifizieren > Bild auswählen. (B) wählen Sie Bild > Art > “RGB-Stack” umwandeln. Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder auszuwählen. (C) Hit “STRG + UMSCHALT + T”, um die “Schwelle” Menü-Einstellungen-Einsteller aufzurufen. Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und mit Foto-Viewer-Programm zu öffnen. Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers. (D) nach ausgewählten drücken Sie “Set” > “OK”. Wählen Sie “Analyse” > “Messungen festlegen” > “Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen” prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard > “OK”. (E) Schließlich wählen Sie “Analyse” > “Measure” (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung “Ergebnisse”). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. (7) DNA Pilz Belastung Entfernen Sie die Lungen von-80 ° C und lyophilize für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist optimal) oder bis vollständig durch ein Einfrieren Trockensystem getrocknet. Während die Lunge trocknen, bereiten Sie DNA Extraktionspuffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, und 0,5 % SDS zu). Ort der vorbereiteten DNA Extraktionspuffer im Wasserbad 60 ° C Vorwärmen. Legen Sie auch Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) in einem 50 mL konische Röhrchen und Trennung zu ermöglichen. Legen Sie die lyophilisierten Lungen in einem 2-mL-Schraubverschluss Rohr mit 0,2 mL Glasperlen. Mit einem Wulst-Schläger, Mahlen Sie trocken Lungengewebe für 15-30 s, bis ein feines Pulver entsteht. Hinzu kommen 0,8 mL warmen DNA Extraktionspuffer jedes Rohr und Wirbel gut. Inkubieren Sie jedes Rohr für 15 min bei 65 ° C Perle Badewanne und dann Wirbel vor der Inkubation für eine zusätzliche 15 min. Nach der Inkubation, Wirbel und dann Zentrifuge Röhren bei 25.000 x g für 10 Minuten. 3 Sätze von 1,5 mL Röhrchen für jede der Proben beschriften und die oberste Schicht des Überstands in einer Reihe von Röhren zu übertragen. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren, wässrigen Deckschicht, um nicht zu stören, die mittlere Schicht. Gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen und gut verrühren. Anschließend Zentrifugieren Sie bei 25.000 x g für 15 min vor, die obere Schicht in die zweite Reihe von Röhrchen pipettieren. Gleiches Volumen an Chloroform: Isoamyl Chloroform hinzufügen, gut mischen und Zentrifugieren bei 25.000 x g für 10 min. sorgfältig Pipette aus der oberen Schicht in die dritte Reihe von Röhren. Hinzufügen von 500 µL Isopropanol und 50 µL NaoAc (pH 5,2), gut mischen und Proben bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Dann bei 25.000 x g für 30 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 750 µL aus Eis kalt 70 % Ethanol und Zentrifuge für 5 min bei 25.000 x g. Dekantieren das Ethanol und lassen Sie die Pellets in die Luft in den Rohren in einem Rauch-Hauben für 40 min trocknen. Die trockene Pellets in 300 µL TE-Puffer aufzuwirbeln.Hinweis: Die DNA kann bei-20 ° C bis quantifiziert gelagert werden. DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren und 100 µL 0,2 µg/µL jeder DNA-Probe für qPCR Analyse vorzubereiten. Ein standard qPCR in dreifacher Ausführung mit 1 µg DNA-Probe, Pilz 18 s rDNA Grundierung, wie zuvor beschrieben durchführen und Sonde setzt mit einer modifizierten Sonde Quencher (5’- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 “)12,13. Bereiten Sie eine Standardkurve aus genomischer DNA A. Fumigatus und berechnen Sie die Konzentration der Pilz DNA in Pg in jeder Probe unter Verwendung der durchschnittlichen Reporters färben Ct-Werte. Zeichnen Sie die Pg/µg Pilz DNA mit Standardfehler des Mittelwerts. Führen Sie ein Student t-test Analyse Bedeutung zu bestimmen.Hinweis: als eine weniger giftige Alternative zu den hierin verwendeten Phenol-Chloroform-DNA-Extraktion, Spalte basierend DNA-Extraktion Kits verwendet werden.