Histologische kwantificering te bepalen van de schimmel last long in experimentele aspergillose

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Indiana State University, de campus van de gastheer van de Indiana University School of Medicine — Terre Haute. 1. bereiding van A. fumigatus conidiën infectie Tijdens het werken in een goed geventileerde zuurkast, meng 125 µL van A. fumigatus 293 stockoplossing met 900 µL cel cultuur rang water (CCGW). Breng de oplossing voor mout extract (MEA) agarplaat via pipet en gelijkmatig met een inoculating lus. Bewaar de schimmel plaat in het donker bij 24 ° C gedurende ten minste 14 dagen en ten hoogste 28 dagen. Oogst conidiën met glasparels zoals eerder beschreven9. Giet 1.5 g van 0.5 mm glaskralen op het bord en zachtjes heen en weer kantelen totdat de parels om te halen conidiën zijn bekleed. Het verzamelen van de kraal/conidiën mengsel in een conische buis 15 mL. Schorten in 5 mL Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en vortex. Tellen de conidiën in een 50 x verdunning supernatant in de DPBS met behulp van een hemocytometer. Tellen van het aantal conidiën in het gebied dat is afgebeeld in Figuur 1 en vergelijking 1 gebruiken voor het berekenen van de concentratie.#Conidia × verdunning Factor 10 ×4= conidiën/mL (vergelijking 1)Opmerking: Extra 4 x 4 vierkant in de hoeken gebieden kunnen worden geteld, met het gemiddelde van deze gebieden als #Conidia in vergelijking 1gebruikt. Figuur 1: Hemocytometer representatieve ruimte gebruikt voor conidiën tellen (box, pijl). Verdun de conidiën vering met steriele zoutoplossing (DPBS) te verkrijgen van de gewenste concentratie, 1.0 x 108 conidiën/mL voor infectie met 5 x 106 conidiën/50 µL. bereiden 50 µL van conidiën oplossing ‘n + 2’ muizen besmet voor pipetteren account fout.Opmerking: Standaard schimmel oogst en voorbereiding/filtratie mogelijk als alternatief gebruikt10. De glazen kraal methode is het best gebruikt om ervoor te zorgen dat de conidiën monsters met minimale kleine/oplosbare hyphal antigenen voor aspiratie worden verkregen. 2. bij immuunsuppressie en infectie van lymfkliertest Model Het gebruiken van 7-10-week-oude muizen.Opmerking: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil-deficiënte (ΔdblGATA, achtergrond van de BALB/c), en γδ T-cel-deficiënte (TCRδ-/-, B6 achtergrond) muizen werden gebruikt voor deze studie. Voor elk experiment, leeftijd en geslacht-matched werden (zowel mannen als vrouwen) muizen gebruikt voor elke groep. Afbreken van neutrofielen via intraperitoneaal (IP) injectie van 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly – 6G antilichaam in een steriele zoutoplossing op 45° in het laterale lagere juiste kwadrant (voor een experimentele schema, Zie Figuur 2). 24 uur later, infecteren muizen door aspiratie met 5.0 x 106A. fumigatus conidiën geschorst in 50 µL steriele zoutoplossing (Zie stappen 2.4-2.10)11zoals hiervoor is beschreven. Een subset van dieren met antimycoticum zoals 5 mg/kg caspofungine DIACETAAT in DPBS gebruikt in deze studie na infectie, injecteren (dagelijks, Zie Figuur 2). Anesthetize muizen met 99,9% Isofluraan met behulp van een veterinaire anesthesie-machine. Plaats een papieren handdoek op de grond van de kamer van de inductie om ontlasting en urine te vangen. Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van inductie, beveiligen van het deksel en de vaporizer ingesteld op 5% Isofluraan voor 2 min en 30 s.Opmerking: Dierenarts zalf wordt niet gebruikt omdat de totale tijd onder verdoving minder dan 5 min is. Verminderen van de vaporizer aan de helft van de maximale instelling voor 30 s. Bevestigen dat de muis is goed verdoofd door het observeren van vertraagde ademhaling, gebrek aan beweging en gebrek aan respons op Teen-snuifje prikkel. Verwijder de muis uit de inductie kamer en plaats op een bord van de inslag. Plaatst u de muisaanwijzer met de rug tegen het bord. Ervoor zorgen dat de bovenste snijtanden zijn voorzichtig worden gefixeerd met een elastiekje en de onderste snijtanden zijn voorzichtig worden gefixeerd met een metalen draad. Zorgvuldig de tong op volledig uittrekbaar met kleine pincet en Pipetteer 50 µL van conidiën/PBS ophanging aan de voet van de tong te houden. Houd de tong volledig uittrekbaar; luisteren voor snelle ademhaling en de verschillende klikkende geluid van aspiratie. Houd gedurende 20 s of tot schorsing is volledig aanzuiging. Verwijder de muis uit de inslag van bestuur en zachtjes te plaatsen in een kooi voor observatie. Na aspiratie, moet de muis herwinnen bewustzijn binnen 1 min. Monitor de muis totdat volledig bewust en in staat om te lopen rond de kooi. De dieren moeten worden gehuisvest bij 21 ° C en gecontroleerd tweemaal daags totdat de longen worden geoogst. Herhaal de uitputting van de neutrofiele granulocyten (stap 2.2) 24u na infectie (Figuur 2). Figuur 2: Experimental schema. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie8gewijzigd. 3. de oogst en het behoud van muis longen histologische p.a. Anesthetize diep het dier met een fatale dosis van 0,1 ml van 390 mg/ml pentobarbital natrium oplossing IP. Euthanasie bevestigen door het observeren van gebrek aan spontane ademhaling en uitblijven van antwoord aan ledematen stimulatie met een pincet. Zodra euthanized, spray het karkas met 70% ethanol te steriliseren. Plaats het karkas op een bord van de schuim bedekt met een absorberend stootkussen.Opmerking: Het karkas moet worden geplaatst op zijn rug met pinnen voor de beveiliging van alle vier de ledematen aan de Raad van het schuim. Open de holte van de bovenste borst met behulp van schaar met de nodige voorzichtigheid. De ribbenkast weg knippen om bloot van de longen en het hart. Snijd de vena cava inferior toe voor perfusie. Vermijd het snijden van de bloedvaten en organen prikken. Langzaam perfuse met 5 mL koude DPBS in het rechterventrikel van het hart in een hoek van 45° met een 25-G naald. Herhaal de perfusie met 5 mL van de 10% formaline. Zorgvuldig bloot van de luchtpijp en de omringende vet pads losmaken. Ga voorzichtig te werk en Vermijd prikken in de luchtpijp. Zorg ervoor dat het overmatige bindweefsel wordt verwijderd om volledig visualiseren de luchtpijp voordat u verdergaat. Zodra de luchtpijp wordt blootgesteld, plaats onder de luchtpijp te verheffen het pincet. Porren een klein gaatje in de bovenste luchtpijp met behulp van een 25-G naald.Opmerking: Het gat moet worden geplaatst zodat de gehele canule in de luchtpijp past. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de luchtpijp bezwijken. Plaats een canule door het gat en naar de longen. Beveilig de canule met een chirurgische draad gebonden losjes rond de luchtpijp.Opmerking: Als de luchtpijp is gescheurd, de canule kan worden geplaatst langs de luchtpijp zoveel mogelijk in de luchtweg. Met behulp van een injectiespuit, blazen de longen met 1 mL 10% formaline buffer via de canule. Zorg ervoor dat de inflatie van de longen zichtbaar. Als dat niet het geval is, passen de katheter en herhaal. Zodra de longen worden opgeblazen, snel verwijderen van de canule met de nodige voorzichtigheid en draai de draad veilig in het afschermen van de luchtpijp.Opmerking: Als de luchtpijp is gescheurd en de longen niet kunnen worden opgepompt, de longen nog kunnen worden geoogst, maar dit kan voorkomen dat goede fixatie. De luchtpijp en de longen zachtjes verwijderen uit de borst door zorgvuldig loskoppelen van het bindweefsel van de luchtpijp met een tang terwijl zachtjes te trekken tot op de draad. Plaats de longen en luchtpijp in een conische buis van 50 mL met 15 mL 10% formaline buffer. Plaats een uiteinde van de draad buiten de buis en verzegel het GLB. Omkeren van de buis om volledig onderdompelen het monster in fixeerspray. Opslaan van de monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur of totdat zij worden verwerkt.Let op: Formaline is gevaarlijk. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen met inbegrip van bril en een gezichtsmasker. Werken onder een chemische motorkap bij de verwerking van de monsters. 4. de oogst en het behoud van muis longen voor DNA schimmel last Stappen 3.1-3.5 zoals hierboven beschreven op een aparte muis. Langzaam perfuse met 10 mL koude DPBS in het rechterventrikel van het hart in een hoek van 45° met een 25-G naald. Accijnzen van de longen met een schaar en plaats in gelabelde 1,5 mL tubes. De longen bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt. Gebruik standaard technieken zoals beschreven (insluiten en segmentering) en volgens de protocollen van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). 5. microscopie en Imaging De kwantificering beeldbewerkingsprogramma te openen (Zie Tabel van materialen). Met behulp van een lichte Microscoop, verkrijgen ten minste 4 verschillende velden van de GMS gekleurd dia’s (10 X doelstelling). Zorgen dat de beelden vertegenwoordiger van de besmette luchtwegen in de longen met soortgelijke weefsel dichtheid zijn.Opmerking: Als de dichtheid en de distributie van hyphal foci aanzienlijk verschillen tussen controle en experimentele groepen weergegeven, extra velden kunnen worden genomen, of de GMS-gebied van de gehele Long sectie Image kan worden gemaakt (4 X doelstelling). Afbeeldingen van dezelfde gebieden van de Long (geïdentificeerd door gelijkwaardige weefsel morfologie) op een sectie van de seriële Long gekleurd met haematoxyline en eosine, verkrijgen indien gewenst. Voeg schaal bars aan de beelden waar nodig en sla de afbeeldingen moeten worden gekwantificeerd. Selecteer, bewerken > Add/Edit kalibratie merken > Menu: lijn dikte, kleur en schaal bar formaat kiezen > Klik op de afbeelding voor waar de schaal bar is te worden geplaatst. Hiermee sluit u het Menu en kies, bewerken > samenvoegen > samenvoegen kalibratie merken > Kies bestand opslaan als > naam van het bestand en klik op opslaan. 6. met behulp van een Image Processing Program voor het berekenen van de schimmel last (Figuur 3) Open een beeld processing programma. Selecteer Bestand > map met monsters te kwantificeren > afbeelding (figuur 3A). Selecteer Beeld > Type > omzetten in “RGB Stack” (figuur 3B). Gebruik de pijl-rechts-toets om de tweede van de drie bepaalde beelden (figuur 3B). Raken van “controle + verschuiving + T” om de “Drempel” menu instellingen adjustor (Figuur 3 c). Zoek de oorspronkelijke .tiff- of JPG-afbeelding als een referentie en open met een afbeelding weergeven programma (Figuur 3 c). Trek de bovenste schuifregelaar helemaal naar links en de onderste schuifknop totdat het gebied geselecteerd (in rood) is de vertegenwoordiger van het beeld van de microscopie (meestal variërend van 130-160 zoals rechts van de schuifregelaar (Figuur 3 c). Zodra geselecteerd, druk op “Set” > “OK” (figuur 3D). Selecteer “Analyseren” > “Set metingen” > check van “Gebied, gebied de Fractie, te beperken tot drempel, Display Label” en laat de onderkant instellingen (de waterdruppel-waas spijskaart en decimalen) als standaard > “OK” (figuur 3D). Belangrijke gebieden van witruimte of achtergrondkleuring kunnen worden uitgesloten door de selectie van het juiste weefsel met een gebied of veelhoek. Ten slotte selecteert, “Analyze” > “Maatregel” (een venster met gegevens wordt weergegeven, of een tabblad op de windows-taakbalk weergegeven met het label, “Resultaten”) (figuur 3E). De gegevens overbrengen naar een data-analyseprogramma voor graphing en statistische analyse. Het gemiddelde van de vier gebied percentages voor elk monster Long invoeren. 5-8 monsters zijn in het algemeen voldoende om het detecteren van de verschillen tussen groepen. Als het vergelijken van twee experimentele groepen, voert u een ongepaard student t-test om te bepalen van betekenis. Figuur 3: vertegenwoordiger screenshots voor elke stap van GMS histologische field kwantificering. (A) selecteert u Bestand > map met monsters te kwantificeren > Selecteer afbeelding. (B) Selecteer Beeld > Type > omzetten in “RGB Stack”. Gebruik de pijl-rechts-toets om de tweede van de drie bepaalde beelden. (C) Hit “control + shift + T” om de “Drempel” menu instellingen adjustor. De oorspronkelijke .tiff- of JPG-afbeelding als een verwijzing zoeken en openen met foto viewer-programma. Haal de bovenste schuifregelaar helemaal links en past u de schuifregelaar onder totdat het gebied geselecteerd (in rood) is de vertegenwoordiger van het beeld van de microscopie (meestal variërend van 130-160 zoals rechts van de schuifregelaar. (D) zodra de geselecteerde pers “Set” > “OK”. Selecteer “Analyseren” > “Set metingen” > check van “Gebied, gebied de Fractie, te beperken tot drempel, Display Label” en laat de onderkant instellingen (de waterdruppel-waas spijskaart en decimalen) als standaard > “OK”. (E) tot slot Selecteer “analyseren” > “Maatregel” (een venster met gegevens wordt weergegeven, of een tabblad op de windows-taakbalk weergegeven met het label “Resultaten”). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 7. DNA schimmel last De longen verwijderen-80 ° C en lyophilize gedurende ten minste 4 uur (‘s nachts is optimale) of tot volledig gedroogd door een droog systeem van bevriezen. Terwijl de longen drogen, bereiden DNA-extractie-buffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, en 0,5% SDS). Plaats de bereid DNA-extractie-buffer in een bad van 60 ° C water vooraf opwarmen. Ook het plaatsen van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) in een conische buis van 50 mL en voorzien in een scheiding. Plaats de gelyofiliseerd longen in een schroefdop van 2 mL tube met 0,2 mL glazen kralen. Met behulp van een klopper kraal, grind droog longweefsel voor 15-30 s totdat het vormt een fijn poeder. Voeg goed 0.8 mL warme DNA-extractie buffer toe aan elke buis en vortex. Incubeer elke buis gedurende 15 min. in een bad van 65 ° C kraal en vervolgens vortex vóór het incuberen voor een extra 15 min. Na incubatie, vortex, waarna centrifuge buizen bij 25.000 x g gedurende 10 minuten. Label 3 sets van 1,5 mL tubes voor elk van de monsters en breng de bovenste laag van de bovendrijvende substantie in een set van buizen. Wees voorzichtig terwijl pipetteren uit de bovenste laag van waterige om verstoring van de middelste laag. Voeg gelijke hoeveelheid fenol: chloroform: Isoamylalcohol toe en meng goed. Centrifugeer dan bij 25.000 x g gedurende 15 minuten vóór pipetteren uit de bovenste laag in de tweede set van buizen. Toevoegen van gelijk volume chloroform: isoamyl chloroform, meng goed en centrifugeer bij 25.000 x g gedurende 10 minuten zorgvuldig Pipet uit de bovenste laag in de derde set van buizen. Voeg toe 500 µL van isopropanol en 50 µL NaoAc (pH 5.2), meng goed, en laat monsters te broeden bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Vervolgens Centrifugeer bij 25.000 x g gedurende 30 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Wassen van de DNA-pellet met 750 µL van ijs koud 70% ethanol en Centrifugeer gedurende 5 min op 25.000 x g. Decant de ethanol en laat dat de pellets aan de lucht drogen in de buizen in een fume hoods voor 40 min. Resuspendeer de droge korrels in 300 µL van TE buffer.Opmerking: Het DNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C tot gekwantificeerd. Kwantificeren van DNA met een spectrofotometer en 100 µL van 0,2 µg/µL van elk DNA-monster voorbereiden qPCR analyse. Het uitvoeren van een standaard qPCR in drievoud met 1 microgram van DNA-monster, schimmel 18S rDNA primer, zoals hiervoor is beschreven en sonde wordt ingesteld met een aangepaste sonde quencher (5′- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3’)12,,13. Voorbereiden van een standaard curve van A. fumigatus genomic DNA en bereken de concentratie van schimmel DNA in pg in elk monster met behulp van de gemiddelde verslaggever kleurstof Ct-waarden. Plot de pg/µg schimmel DNA met de standaardfout van het gemiddelde. Uitvoeren van een student t-test analyse om te bepalen van betekenis.Opmerking: als een minder toxisch alternatief voor de DNA-extractie van fenol-chloroform gebruikt hierin, kolom op basis van DNA-extractie kits kunnen worden gebruikt.