القياس الكمي نسيجية لتحديد عبء الرئة الفطرية في أسبيرجيلوسيس التجريبية
Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد عبء الفطريات الرئوية في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية بالتحديد الكمي للفضة ميثاناميني المعدلة جوموري لتلطيخ في أقسام النسيجي. استخدام هذا الأسلوب أدى إلى نتائج قابلة للمقارنة مع الحيوانات أقل مقارنة بتقييم عبء الفطرية PCR الكمي للرئة الفطرية الحمض النووي.
Abstract
التحديد الكمي لعبء الرئة الفطرية أمر حاسم لتحديد المستويات النسبية للحماية المناعية وضراوة الفطرية في نماذج الماوس للرئة الفطرية. على الرغم من أن تستخدم أساليب متعددة لتقييم عبء الفطرية، برز الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر) للحمض النووي الفطرية كأسلوب مع العديد من المزايا السابقة الأساليب القائمة على الثقافة. حاليا، تقييما شاملا لأمراض الرئة وتجنيد الكريات البيض وعبء الفطرية والتعبير الجيني في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية (IA) يتطلب استخدام عدد كبير من التجارب ومراقبة الحيوانات. هنا كان درس التحديد الكمي للرئة النسيجي تلطيخ لتحديد عبء الفطرية باستخدام عدد أقل من الحيوانات بالتفصيل. أقسام الرئة كانت الملون لتحديد هياكل الفطرية مع جوموري لتعديل ميثاناميني الفضة (GMS) تلطيخ. صور مأخوذة من أقسام الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى من 4 حقول منفصلة كل الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين الفورمالين–الثابتة. منطقة الميكونج الكبرى الملون المناطق داخل كل صورة كانت كمياً باستخدام برنامج تحليل صورة، ومتوسط النسبة المئوية للمنطقة الملون من هذا التحديد الكمي، مصممة لكل عينة. باستخدام هذه الاستراتيجية، تفتقر إلى eosinophil الفئران أظهرت انخفض عبء الفطرية والمرض مع العلاج كاسبوفونجين، بينما لم تتحسن الفئران البرية من نوع مع IA مع كاسبوفونجين. وبالمثل، عبء الفطرية في الفئران التي تفتقر إلى خلايا γδ تي كما تحسنت ب caspofungin، مقاسا قبكر والتقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى. ولذلك هو عرض التحديد الكمي في منطقة الميكونج الكبرى كوسيلة لتحديد عبء النسبي الرئة الفطرية التي يمكن في نهاية المطاف خفض كمية الحيوانات التجريبية اللازمة لإجراء دراسات شاملة ل aspergillosis الغازية.
Introduction
IA هو عدوى الانتهازية التي قد تتطور في الأفراد عرضه مع القصور المناعي الخلقية أو المكتسبة بسبب العلاج المناعي القمعية أو العدوى المزمنة1،2. الإصابة الأولية غالباً ما يحدث في الرئتين، على الرغم من أن في بعض الحالات نشر رشاشيه دخناء إلى الكبد والكلى والقلب، وقد تحدث الدماغ، أدى غزو الأنسجة واسعة من خيوط فطرية مصحوبة بأمراض شديدة وعالية معدلات الوفيات1،2. وعلاوة على ذلك، فعالية القائمة فارماكوثيرابيس محدودة، وقد يكون زاد من ضعف بسبب ظهور سلالات مقاومة لمضاد في البيئة3. ولذلك من المهم لفهم آليات الأمراض الفطرية الفوعة والمضيفة التي تعزز التنمية أو تفاقم الأمراض الفطرية الغازية.
نماذج مورين تظل هامة الميكانيكية IA الدراسات، كما أنها تسمح للباحثين لتقييم أدوار الجينات الفوعة الفطرية واستضافة المناعي المستجيبة لإنشاء ونمو دخناء (أ) المجراة في4،5. ونتيجة لذلك، تم وضع استراتيجيات متعددة بغية قياس أو مقارنة عبء الفطرية في مجموعات من الحيوانات التجريبية6،7بشكل فعال. تشمل هذه الاستراتيجيات المناعة على أساس الثقافة، والكيمياء الحيوية، أو الأساليب قبكر، مع مميزة من مزايا وعيوب كل. وعلاوة على ذلك، كل من هذه الأساليب تنطوي على تفاني مجموعة فرعية حيوانات بالإضافة إلى تلك التي ضحى من أجل تقييم الدالة المستجيب محصنة وتحليل التعبير الجيني، والأنسجة مقارنة7. وبالتالي، غالباً ما تتطلب دراسات IA شاملة إعداد كبيرة من الحيوانات للبحث بتكلفة كبيرة. استراتيجيات فعالة لتقليل وقت التجريبية والتكاليف الحيوانية والاعتبارات الأخلاقية باستخدام الأنسجة الحيوانية لتحليلات متعددة هي بالتالي قيمة للغاية7.
في هذا التقرير، هو عرض أسلوب تصف التحديد الكمي لمنطقة الميكونج الكبرى تلطيخ في مقاطع نسيجية للمقارنة عبء الفطرية النسبي بين المجموعات التجريبية من الفئران مع IA. يتم وصف كل خطوة من الثقافة الفطرية للعدوى والأنسجة الحصاد والتجهيز، والحصول على الصور وتحليل البيانات، بالتفصيل. الأعباء الفطرية التي حصل عليها تقدير حجم منطقة الميكونج الكبرى قورنت مع قبكر في نماذج نيوتروبينيك من ألف وفي الفئران البرية من نوع أو تفتقر إلى eosinophil caspofungin تعامل مع IA8. وأظهرت النتائج تشابه مع التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى و qPCR للحمض النووي الفطرية. وهذا يوحي بأن القياس الكمي منطقة الميكونج الكبرى قد تكون مفيدة للباحثين المشاركين في التحليل النسيجي كوسيلة تكميلية أو بديلة من المقارنة بين العبء النسبي الفطرية في الفئران مع IA، وربما في نهاية المطاف تقليل التكلفة واستخدام الحيوانات للبحث في دراسات معقدة، والميكانيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الغرض من هذه المادة الأخذ بأسلوب لتحديد عبء الرئة الفطرية في الفئران مع IA باستخدام مقاطع نسيجية الرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى لتحليل الصور والقياس الكمي. في هذه الدراسة، العلاج بالمخدرات المضادة للفطور β-غلوكان-توليف-استهداف caspofungin14 لم يحسن البقاء على قيد الحياة أو عبء الفطرية في الفئران البرية من نوع نيوتروبينيك مع IA8. ومع ذلك، في غياب الحمضات أو خلايا γδ T، البقاء على قيد الحياة وعبء الفطرية تحسنت. وأظهرت نتائج الدراسة أيضا أن عبء الفطرية منطقة الميكونج الكبرى بالمقارنة تستخدم على نطاق واسع الفطرية الحمض النووي qPCR الأسلوب6ويمكن الحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
هناك فوائد عديدة لاستخدام منطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي. أولاً، العملية قد تستخدم عينات نسيجية القائمة، وبالتالي يحتمل أن خفض عدد التجارب اللازمة لتحديد الاختلافات الهامة. وثانيا، في هذه الدراسة، كانت أقل الحيوانات المطلوبة لمنطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي لتحقيق فروق كبيرة بالمقارنة مع قبكر الفطرية الحمض النووي (الشكل 6، رقم 7). ثالثا، مقارنة بين عبء الفطرية في يعزل مختلفة من قبكر قد تتأثر تعتمد على عزل الاختلافات في نسخة الحمض النووي ريبوسومال رقم15. وفي المقابل، التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى لا يتأثر بعدد النسخ، كما يتحدد عبء الفطرية بالمستويات النسبية لنمو الفطريات الرئة. وهكذا، استخدام منطقة الميكونج الكبرى التقدير الكمي لعبء الفطرية يقلل من استخدام الحيوانات الفقارية ولا تتطلب قبل تحديد عدد النسخ المتاشب. وأخيراً، بالإضافة إلى تعديل مورفولوجيا الفطرية، العلاج كاسبوفونجين يزيد من تجزئة الفطرية، وبالتالي قد مصطنع زيادة عبء الفطرية عندما تقاس بعزل الوحدات تشكيل مستعمرة من الرئة هوموجيناتيس12،16 ،17. وهكذا يتجنب الكمي GMS لعبء الفطرية العديد من القيود المتأصلة مع أساليب أخرى شائعة الاستخدام.
بيد أن القيود المفروضة على منطقة الميكونج الكبرى القياس الكمي و/أو هذه الدراسة من المهم ملاحظة. أولاً، الكتاب يفترض توزيع النمو أصله في جميع أنحاء الرئتين لكل مجموعة تجريبية بصورة قابلة لمقارنة، وهكذا تستخدم الكمي من الممثل 4 10 × حقول موضوعية كقياس تمثيلي لعبء الفطرية في الرئة كاملة (الشكل 6B). فمن الممكن أن في بعض الحالات التوزيع النسبي، وحجم وكثافة من البؤر أصله بما فيه الكفاية تختلف حيث أن عبء الفطرية تبدو مختلفة مع هذا الأسلوب وما يعادلها بواسطة الأسلوب قبكر. ومع ذلك، لدينا نتائج إضافية مع الرئة كله قسم الكمي باستخدام مجالات موضوعية X 4 أظهرت مماثلة، وأن كانت أقل فروق معتد بها إحصائيا، بين المجموعات (الشكل 6). الخطأ المعياري للتقدير الكمي هذا زيد مع هذه الاستراتيجية، يرجح أن سبب انخفاض القرار أصله مع 4 × الهدف والخلفية زيادة في الحقول دون الحد الأمثل. لذلك، إجراء تقييم كمي ممثل لحقول أقل في أعلى التكبير المفضل. وثانيا، استخدمت فقط قسم واحد، وسط لكل عينة. فمن الممكن، استناداً إلى يعزل الفطرية أو استخدام سلالات الفئران، أن بعض الدراسات قد تؤدي إلى توزيع غير متكافئ للنمو أصله. وفي تلك الحالات، ينبغي كمياً مقاطع إضافية في جميع أنحاء كل كتلة البارافين للحصول على عبئا أكثر تمثيلاً. ثالثا، في التجارب التي تحفز إنتاج كبيرة من موكنيس (أي، تحديد مجرى الهواء نمو الفطريات في الحساسية القصبية الرئوية aspergillosis (ABPA)18 أو التليف الكيسي (CF)18)، منطقة الميكونج الكبرى تفاعلية مع يمكن غير محددة إلى منطقة الميكونج الكبرى + نتائج الغنية السكاريد موكنيس19 وهكذا انحراف بعض العينات صالح أعلى عبء الفطرية. منذ فقط نموذج نيوتروبينيك IA استخدمت في هذه الدراسة، فمن الممكن أن استخدام النماذج المختصة أو القمعية الأخرى محصنة يمكن أن يسفر عن نتائج أقل قابلة للمقارنة. وعلى الرغم من هذه المحاذير، والكمي GMS يوفر تقنية قابلة لمقارنة لتحديد عبء الفطرية، واستعماله المستمر في إجراء دراسات إضافية قد كذلك التحقق من فائدة هذا الأسلوب متسقة وموثوق بها وفعالة من حيث التكلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة في جزء من “إنديانا جامعة مدرسة من الطب البحوث تعزيز منحة” ومن المعاهد الوطنية للصحة-نييد 1R03AI122127-01. N.A. جزئيا تدعمها خلال هذه الفترة مهن في “زمالة علم المناعة” من “الرابطة الأمريكية للمناعة”.
Materials
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus–what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?. PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
