والتصور والتقدير الكمي للخلايا الوسيطة أديبوجينيك التمايز المحتملة مع علامة نسب المحددة
Summary
الأساليب التقليدية لتقييم التمايز أديبوجينيك رخيصة وسهلة الاستخدام، ولكن لا تقتصر على التغيرات في التعبير الجيني. وقد وضعنا مقايسة التحديد الكمي لتمايز الخلايا الوسيطة في adipocytes ناضجة باستخدام علامة محددة نسب. هذا التحليل قد تطبيقات متنوعة عبر البحث الأساسي والطب السريري.
Abstract
صبغات عديدة متاحة حاليا للاستخدام في الكشف عن تمايز الخلايا الوسيطة في adipocytes. الأصباغ، مثل “النفط الأحمر س”، رخيصة وسهلة الاستخدام والاستفادة منها على نطاق واسع بمختبرات تحليل إمكانات أديبوجينيك الخلايا الوسيطة. ومع ذلك، فليست محددة للتغييرات في النسخ الجيني. وقد وضعنا مقايسة المفاضلة الخاصة بالجينات لتحليل عندما تحول خلية الوسيطة مصيرها إلى نسب أديبوجينيك. وضع العلامات المناعية ضد الأحماض الدهنية ملزمة البروتين-4 (FABP4)، علامة خاصة بالنسب للتفريق بين أديبوجينيك، مكن التصور والتقدير الكمي للخلايا المتمايزة. القدرة على تحديد إمكانية التفريق أديبوجينيك الخلايا الوسيطة في شكل 96 ميكروسكوبية جيدا قد آثار تبشر بالخير بالنسبة لعدد من التطبيقات. مئات تجارب السريرية تنطوي على استخدام الخلايا اللحمية الوسيطة الكبار ومن الصعب حاليا لربط النتائج العلاجية داخل، ولا سيما بين تلك التجارب السريرية. هذا الإنزيم FABP4 الفائق بسيطة تنص تحليل كمي لتقييم إمكانات تمايز الخلايا المستمدة من المريض، وهو أداة قوية لمقارنة مختلف أساليب العزل والتوسع. وهذا أهمية خاصة نظراً لتزايد الاعتراف بعدم تجانس الخلايا تدار للمرضى في المنتجات الوسيطة الخلية. أيضا قد المقايسة الفائدة المحتملة في فحص المخدرات عالية الإنتاجية، خاصة في السمنة ومرض السكري قبل البحث.
Introduction
أحد المتطلبات الرئيسية التي أنشأها “المجتمع الدولي” للعلاج الخلوي (إيسكت) لتحديد خلية stromal mesenchymal multipotent أن الخلايا يجب أن يكون لديك القدرة على التفريق في أديبوجينيك، أوستيوجينيك والأنساب تشوندروجينيك 1-الطرق التقليدية لقياس التمايز في هذه السلالات الثلاث تعتمد على الكشف عن منتجات الجزيئات باستخدام الأصباغ الكيميائية1. الأصباغ مثل “النفط س الأحمر” (الذي البقع قطرات الدهون في الخلايا التي خضعت أديبوجينيسيس)، رخيصة وسهلة الاستعمال؛ إلا أنها تفشل في الكشف عن التغييرات المحددة في تعبير الجينات التي تحدث عند التفريق بين الخلايا الوسيطة في كل النسب الخاصة بكل منها2. هنا، وقد وضعنا مقايسة المفاضلة التي يوضحها التعبير البروتين لعلامة خاصة بنسب أديبوجينيك، الأحماض الدهنية ملزمة البروتين-4 (FABP4)3،،من45. FABP4 عثر عليها في البداية في 3T3-L1 مورين adipocytes3 وتبين فيما بعد أن يتم التعبير عنها في الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشرية6. هو بروتين سيتوسوليك، التي تعمل بوصفها كوصي لتوجيه امتصاص الأحماض الدهنية من الخلايا وهي تشترك في عملية lipolysis4.
وكانت الخلايا السليفة المستخدمة لفحوصات التمايز المشتقة الوسيطة stromal الخلايا الدهنية (الخزفية)7،8. الخزفية بمشاركة العديد من الخصائص مع المشتقة من نخاع العظام الخلايا الجذعية الوسيطة (بي أم-MSCs)، عدد سكان رئيسية خلية الجذعية الوسيطة في البالغين8،9. الخزفية توفر العديد من المزايا BM-MSCs في تطبيق السريري، كما يمكن أن يكون العائد أكبر من الخلايا المعزولة من أنسجة أكثر سهولة مصادر8،9. يحتاج سكان خلية معزولة للوفاء بمعايير معينة يمكن تحديدها الخزفية. أولاً، يجب أن يظهروا الانضمام إلى السفن البلاستيكية زراعة الأنسجة في الظروف القياسية الثقافة1. يجب أن يظهروا أيضا محددة مستضد السطحي التعبير1. تتميز الخزفية جاهل بتعبير إيجابي للمستضد السطحي CD34، CD73، CD90، منخفضة من التعبير عن CD105 والتعبير السلبي CD45 والدكتور هلا10. الخزفية تنقيته من استزراع البلاستيك لمدة 28 يوما (تمسكا تنقية الخزفية) إظهار التعبير الإيجابي CD73 و CD90 و CD105 والتعبير السلبي CD34، CD45 والدكتور هلا10. وأخيراً، يجب أن تحتفظ الخلايا القدرة على تمييز في مختلف الأنساب1،،من78.
أديبوجينيك التمايز البروتوكولات حمل upregulation ضرب من التعبير FABP4 بين جينات أخرى النسب adipocyte، حتى نتمكن من استخدام إيمونوتشيميستري لتصور FABP4 البروتين داخل الخلايا، وثم كمياً FABP4 التعبير على مستوى الخلية الواحدة استخدام مجهر فحص محتوى عالي فلورسنت الآلي. هذا الأسلوب مفيد على الأصباغ التقليدية حيث أنه يمكن تأكيد التمايز adipocyte-نسب محددة للغاية. هذه فحوصات محددة النسب الجينات جنبا إلى جنب مع المحتوى العالي من فحص أساليب أيضا تمكين التحديد الكمي لنسبة الخلايا ضمن تحضير خلية غير متجانسة قادرة على التمايز إلى أسفل نسب معينة. في دراساتنا استخدمنا الإنزيم FABP4 لتأكيد فقدان إمكانية التفريق أديبوجينيك الخزفية طازجة معزولة بعد زراعة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الورقة تبين جدوى ومزايا إيمونولابيلينج FABP4 لدقة كشف وتحديد adipocytes ناضجة المستمدة من الخلايا اللحمية الوسيطة. FABP4 قادراً على الكشف عن التغييرات في التعبير عن نسب البروتين محددة3،4،5 في adipocytes ناضجة، خلافا للبعض يشيع استخدام الأصباغ التي تسمية الجزيئات التغييرات13،14 مثل “النفط الأحمر س”15و “النيل الأحمر”16 و “الأسود السودان”17. إيمونولابيلينج FABP4 يسمح لتصور وتحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلوية. هذه هي ميزة مميزة على الأساليب المذكورة سابقا باستخدام النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) الذي يحلل التغييرات على مستوى النص دون أي التخيل5،18،19 ،20، أو التدفق الخلوي التي تتطلب الخلايا في تعليق20، أو الغربية النشاف التي تتطلب الخلايا أن تفكيك لعزل بروتين19،20. إيمونولابيلينج FABP4 هو مستقر في الخلايا الثابتة وعدم تسرب في الحل ويجري بروتين سيتوسوليك عندما وصفت في أحادي الطبقة ملتصقة من الخلايا، وتداخل مع نواة السماح للتصور سهلة وأضاف الدقة في التحليل الآلي.
فحص المحتوى السامي مفيد لأنها سريعة ودقيقة، واستنساخه وموضوعية. فإنه يوفر منبرا لاستخدام فعالة من حيث التكلفة من الكواشف ووقت الباحث، نظراً للحصول على الصور، وتحليل تتطلب الحد الأدنى من التلاعب اليدوي وتعتمد على المعالجة التلقائية للصك. وتم تحديد عدة عوامل ذات أهمية حاسمة للدقة وإمكانية تكرار نتائج الفحص عالية المحتوى فحوصات31. التحديد الكمي للتعبير مستضد يعتمد على جودة الصورة. لتحليل الصور الناجحة، يجب أن يكون في التركيز الصور من كل قناة لكل بئر وتقع ضمن مجموعة ديناميكية أمثل لقيم الرمادي (كشف تلقائي إعدادات مثالية). للخروج من التركيز أو الصور المشبعة تؤدي إلى نتائج خاطئة.
فيما يلي بعض القيود المحتملة من الطرق الموضحة في هذه المقالة. الشرط للبرمجيات المتخصصة والمعدات وتحليل التصوير. بينما خارج نطاق هذه المقالة، يمكن استخدام خيارات البرامج البديلة المفتوحة المصدر (على سبيل المثال، إيماجيج،من3233، فيجي34،32،سيلبروفيلير35) القيام بتجزئة الصورة مماثلة المهام؛ إلا أنها تتطلب مهارات أما تحميل وتكييف وحدات الماكرو المتوفرة على الإنترنت أو كتابة وحدات الماكرو/أوامر لأنابيب تحليل خاص بهم. الملازمة لأنابيب تحليل التصوير الآلي كل شيء مستوى الضوضاء الخلفية. وهذا يمكن أن يعزى إلى حد كبير إلى الحطام، خطأ الصورة رديئة النوعية أو التحليل، وإذ تشدد على الحاجة إلى إعداد نموذج دقيق وإعداد دقيق منهاج التصوير والتحليل. تم العثور على التسمية FABP4 في الفئران للكشف عن30من فروعه غير متمايزة؛ بينما الضوابط في هذه الدراسة (التي تتكون من خلايا غير متمايزة) خالية من تلطيخ FABP4 محددة. هذا عشرات الأطفال دون سن الخامسة متمايز ضرورة تدقيق التعبير FABP4 فروعه في كل سياق البيولوجية التي يعمل فيها المقايسة.
أجل مقارنات صحيحة بين العلامات FABP4 و “يا الأحمر النفط” تلطيخ، قياسات الناتج من تحليل الصور التي ينبغي أن تكون ذات صلة بيولوجيا. ونتيجة لذلك، استخدمت القياس، ‘% إيجابية الخلايا’ FABP4، وكان يستخدم ‘منطقة لتلوين كل خلية’ للنفط الأحمر سين جدير بالذكر أن هذا التدبير ‘% إيجابية الخلايا’ لا يستخدم “النفط س الأحمر” المسمى الخلايا في دراستنا لأنه لم يكن من الممكن عزو قطرات الدهون توسم بدقة إلى نواة معينة؛ قطرات الدهون تختلف كثيرا في الحجم والعدد والتوزيع عبر جسم الخلية، ونادراً ما تتداخل مع النواة. O الأحمر النفط تلطيخ تقلب موجودة بين الخلايا المستمدة من مصادر مختلفة من الأنسجة؛ بينما % إيجابية التدبير الخلايا لم يكن مناسباً للدراسة الحالية، مجموعة أخرى قد استخدمت بنجاح لقياس adipocytes المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية الغدة22 تلطيخ “س الأحمر النفط” حيث ظهرت كأحد الحبرية الدهون الكبيرة التي امتدت السيتوبلازم ومتراكب مع نويات والبيانات التمكينية لتقديمها كخلايا % إيجابية.
وفي المقابل، يتسق مورفولوجية إيمونولابيلينج FABP4 في adipocytes المستمدة من مجموعة من الأنسجة المختلفة المصادر23،،من2425. القدرة على قياس نسبة الخلايا ضمن ثقافة قادرة على التمايز يحتوي على عدد من التطبيقات. الكبار الخلايا اللحمية الوسيطة تبشر هامة لمجموعة متنوعة من الأغراض العلاجية. مسألة من المسائل هامة التي نشأت مع الترجمة السريرية هو التغير المتأصلة في قدرة هذه الخلايا بين المرضى26، بين مواقع لعزل27،28، وبين الأساليب لعزل12 ، وتوسيع نطاق الخلية الأرقام12 للاستخدام العلاجي. قد تبين سابقا أن ثقافات خلايا اللحمية ملتصقة غالباً غير متجانسة، مع بعض الخلايا قادرة على التمايز وليس بعض 12،17 كما لدينا FABP4 يوضح تحليل للثقافات ASC. فحوصات مثل هذا، جنبا إلى جنب مع تقنيات التخصيب، وسيساعد على تحديد السكان الفرعية داخل الثقافات غير متجانسة قادرة على التمايز النسب المحددة. ويوفر طريقة بسيطة للمقارنة بين كل من هذه المتغيرات، والقدرة على تقييم النتائج العلاجية داخل وبين التجارب السريرية بعد مقايسة موحدة، قابلة للقياس، مثل هذا الفحص FABP4.
يمكن التحديد الكمي ل FABP4 بطريقة شبه إليه الموضوعية وإمكانية تكرار نتائج التحليل عبر العديد من الحالات المانحين وعينات. وعلاوة على ذلك كما التسمية هيولى، فإنه يحتمل أن يمكن استخدامها لتحليل تضخم (توسيع حجم adipocyte) بالإضافة إلى تضخم (زيادة في عدد adipocyte)، تمييزاً له أهمية كبيرة في أبحاث السمنة، حيث تضخم يرتبط ارتباطاً قويا بخلل الدهنية في21من الأفراد يعانون من السمنة المفرطة. وقد حفزت وباء السمنة قدرا كبيرا من الاهتمام في تحديد الأدوية قادرة على السيطرة على تخزين الدهون. كما يوفر هذا التحليل FABP4 قراءات بسيطة لفحص آلاف مركبات لقدرتها على منع تراكم الدهون.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للجهات المانحة من الأنسجة الدهنية والمهنيين البحث الذي جمع وتوفير هذه الموارد بالنسبة لنا لاستخدام البحث. ونود أن نعترف بتمويل دعم Allergan. ونحن ممتنون أيضا لجامعة أوكلاند، وكلية الطب والعلوم الصحية على أساس أداء صندوق أبحاث لتمويل تكلفة videoing والتحرير لتقديم هذه المادة.
Materials
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a. Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol – Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O’Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
