Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Osservazione e analisi della crescita delle piante e soprattutto fenotipi da piante mutanti si basano sulle condizioni ambientali stabili e riproducibili. Questi possono essere forniti in camere climatiche. Quantità di luce e soprattutto la qualità dipende criticamente la sorgente luminosa autonomo, che in questo studio è stata fornita da luci a LED. Figura 1 Mostra un esempio di una camera attrezzata con pannelli a LED. Figura 1A Mostra una schermata del pannello di controllo dove tutte le condizioni climatiche e di luce possono essere regolate. Entro 24 h può essere impostate venti lassi di tempo diversi. In questo esempio, condizioni di giorno lungo con luce/8 16h scuro sono state programmate. Questa camera dispone di quattro livelli che possono essere programmati separatamente in modo che la crescita delle piante a quattro diverse impostazioni di luce può essere studiato sotto esattamente le stesse condizioni ambientali. Superiore sinistro del livello è impostata su un output spettrale che imita la luce del sole per quanto tecnicamente possibile, il superiore rappresenta proprio livello elevato rosso (660 nm) e luce blu (440 nm) con ridotta luce bianca (3K). Livello inferiore sinistro era impostato di elevata luce blu e il livello inferiore principalmente luce rossa. Figura 1B illustra i LED presso le diverse impostazioni come una panoramica (pannello centrale) e i rispettivi zoom-in (piccoli pannelli esterni). La differenza nella qualità della luce può essere facilmente visto dall’occhio. Uno spettrometro inbuilt costantemente misure, monitora e regola l’uscita spettrale. La figura 2 Mostra lo spettro dal livello superiore sinistro 1.1, che è stato impostato per simulare la luce del sole. Rispetto ad una normale lampadina fluorescente la porzione di UV e luce blu è molto maggiore di7. Nella Figura 3 un esempio di a. thaliana piante da tutti i giorni quattro condizioni 10, 13 e 17, rispettivamente, dopo la semina è raffigurata. Tutti gli impianti sono stati fotografati dalla stessa distanza da montare la fotocamera su un treppiede. La barra della scala rappresenta 1 cm. Dopo 10 giorni, non molta differenza nella dimensione o il colore può essere discernuto, ma dopo 17 giorni è evidente una crescita più veloce sotto la luce rossa. Oltre a questa analisi visiva, sono state effettuate diverse analisi fisiologiche. Figura 4 segue le varie fasi delle misurazioni di PAM, che permette di analizzare ad esempio la capacità fotosintetica. In Figura 4A uno screenshot del video dal vivo è indicato, che è l’impostazione per portare la pianta a fuoco per garantire una qualità ottimale delle misurazioni. Invece di concentrarsi su tutta la pianta, si può anche scegliere una singola foglia di analizzare. Figura 4B dimostra l’attuale rendimento fluorescente Ft di una pianta scuro-adattata prima la misura reale è stata avviata. In questo caso, sono stati scelti cinque aree circolari di interesse (AOI). I numeri nelle caselle di rosso accanto ogni AOI dà direttamente il risultato numerico, che possa anche essere salvato sotto forma di una tabella. Per avviare una misurazione dei parametri fotosintetici Fo, Fm è necessario impostare. Uno screenshot di Ft dopo aver fatto questo è raffigurato in Figura 4. Si noti che ora il pulsante “Fo, Fm” non è più attivo. Per avviare una nuova misurazione, “Nuovo Record” deve essere cliccato per cancellare la normalizzazione precedente. Infine, la Figura 4 Mostra l’effettivo rendimento quantico PSII y (II) dopo aver dato un impulso di luce saturante (“SAT-Pulse”). Quantificazione dei dati esemplari è illustrato nella Figura 5. Piante coltivate sotto la luce solare a 200 µM/cm2/s1 (Figura 5A) sono state analizzate 12, 21 e 28 giorni dopo la semina, rispettivamente. I nostri dati dimostrano che la resa PSII è significativamente in foglie da piante coltivate per tre settimane rispetto per 12 giorni. La differenza tra 28 e 12 giorni è ancora significativa, ma il p-valore è più alto. In Figura 4B, PSII rendimenti da piante coltivate per due settimane da diverse qualità di luce sono stati confrontati. Interessante, una crescita permanente sotto la luce contenente un’alta parte della luce blu conduce ad un rendimento significativamente maggiore del PSII. Un simile effetto è stato osservato per le piante coltivate sotto luce rossa arricchita, ma l’aumento è stato di poco inferiore. Diverse qualità di luce sono stati indicati per effetto stomi sviluppo14. Di conseguenza, è stata studiata la densità stomatica. Figura 6 di seguito viene illustrato l’aspetto di una foglia dopo l’estrazione del pigmento. Cellule epidermiche singole possono essere ben distinte, e stoma può essere facilmente contato. Nella figura, gli stomi individuali sono indicati da un asterisco. Dati dettagliati circa la densità stomatica delle piante dalle diverse impostazioni di luce possono essere trovati altrove9. Oltre a ispezione visiva (Figura 3) il peso fresco fornisce una buona misura del progresso di crescita. In questo esempio foglie da piante coltivate sotto la “luce solare” dopo 8, 10 e 12 giorni dopo la semina, rispettivamente, sono stati pesati. Valutazione statistica di questi dati può essere visto nella Figura 7. Come previsto, il peso fresco aumenta con il tempo. Oltre di peso fresco, la zona di foglia è una buona misura per la crescita. Qui, lo sviluppo della pianta è stato seguito da 10, 13 e 17 giorni dopo la semina (Figura 8A). Almeno sei diverse piante sono stati valutati ordinariamente per ottenere dati statistici affidabili. Per dimostrare l’importanza di un campione di elevate dimensioni, è stato calcolato l’errore percentuale del valore medio, analizzando due e sei piante, rispettivamente, (Figura 8B). Ciò significa che è stata determinata la percentuale della deviazione standard per quanto riguarda il valore medio. È molto chiaro che, in caso di un campione di piccole dimensioni, l’errore è 5-10% superiore nel caso di una maggiore dimensione del campione. Aumentando il numero di piante che vengono valutate, l’errore può essere minimizzato, che rende l’interpretazione dei dati molto più chiari. Figura 1: diverse qualità di luce sono forniti da LED. A) Screenshot dal pannello di controllo della camera del LED. Lunghezza del giorno è fissata a 16 h (in alto a destra) e l’intensità della luce è impostata su 200 µmol cm-2 s-1. La qualità della luce è diversa su tutti i quattro livelli: 1.1 rappresenta uno spettro simile alla luce del sole come tecnicamente possibili, 1.2 rappresenta un’alta percentuale di rosso e blu lunghezze d’onda (RB) luce, 2.1 è prevalentemente impostata a blu (B), 2,2 rappresenta principalmente rosso luce (R). B) il pannello centrale mostra una panoramica di tutti i livelli; i pannelli esterni mostrano i singoli livelli in un alto livello di zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: spettro di lunghezza d’onda da impostazioni di luce solare simulata. Viene mostrato uno screenshot dello spettrometro insito nella camera di LED, che è stato posizionato a livello 1.1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: impianto di sviluppo più di una settimana. Rappresentante a. thaliana piante da tutte le quattro condizioni di luce da 10, 13 e 17 DAS. Piante sono stati fotografati con una macchina fotografica reflex digitale su un treppiede. Barra della scala rappresenta 1 cm per tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Screenshots da passaggi rappresentativi delle misurazioni di PAM di piante di a. thaliana . A) Screenshot dalla visualizzazione “Live video” dove può essere regolato il fuoco immagine. B) rendimento corrente fluorescenza Ft prima dell’applicazione di eventuali impulsi di luce. C) rendimento corrente fluorescenza Ft dopo l’impostazione di FM Fo /. D) rendimento quantico che effettuano PSII dopo aver impostato un impulso di luce saturante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: rappresentazione grafica del rendimento quantico che effettuano PSII (YII). A) dati da 12, 21 e 28 giorni dopo la semina di piante e coltivati sotto 200 µmol/cm2/s1 sotto luce solare simulata (“luce solare”) sottoposti ad analisi di PAM sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Un asterisco indica una differenza significativa con un valore p < 0,05 rispetto al giorno 12 e due asterischi indicano differenze molto significative con un p-value < 0.02 secondo t-test degli studenti. B) dati da piante coltivate a 200 µmol/cm 2/s1 sotto luce solare simulata (SL), arricchita blue (B) o rosso (R) luce, rispettivamente, sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Differenze significative sono state calcolate rispetto a “luce del sole.” Figura 6: immagine rappresentativa di stomi a fianco di una foglia di a. thaliana abbagliai. Foglie preparato come descritto sopra e sono stati analizzati visivamente sotto un microscopio chiaro con impostazioni di DIC a 40 ingrandimenti. Gli stomi sono contati nell’area visibile di almeno 4 foglie per condizione. La foto è stata scattata con una videocamera digitale collegata al microscopio tubus. Il numero di stomi per mm ² è calcolato con l’aiuto della barra della scala. Stelle indicano una stomia singola. La barra della scala rappresenta 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: rappresentazione grafica di peso fresco da a. thaliana piante coltivate presso simulato del sole/200 µmol/cm2/s1. Rosetta di foglie sono stati tagliati da piante, otto, dieci e dodici giorni dopo la semina. Sono rappresentati i valori medi in mg da sei piante al giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Valutazione statistica della superficie fogliare di a. thaliana da piante coltivate in condizioni di luce diverse. A) area fogliare da a. thaliana coltivata per 10, 13 e 17 giorni è stata determinata graficamente con ImageJ e dati da n = 6 piante sono stati valutati statisticamente. L’area di foglia da tutte le sei rosette da ogni condizione è stata riassunta e divisa da sei per ottenere il valore medio. Con questo valore, è stata calcolata la deviazione standard, e questo è rappresentato da barre di errore. B) area fogliare graficamente è stata determinata con ImageJ e dati da entrambi n = 2 o n = 6 stabilimenti, rispettivamente, sono stati analizzati statisticamente come descritto per il pannello A. Quindi l’errore in percentuale del valore medio è stato calcolato e rappresentato graficamente. Barre verdi indicano la percentuale di errore dall’analisi di n = 6, blu bar da n = 2 piante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.