Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Bu çalışmada meme dokusu malzemenin kullanım için etik onay Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi (UREC üzerinden) Malta Üniversitesi elde edilen (Ref: 22/2012). 1. doku hazırlık Uygun H & E yordamlar14kullanarak, lekeli başvuru doku bölümleri hazırlamak ve dijital olarak slaytlar için başvuru sırasında mikrodiseksiyon inceden inceye gözden geçirmek. Bir microtome kullanarak yarma 20 µm doku üzerine 40 ° C’de RNAse free bir su banyosu Temiz, RNase dekontamine ekipman ve malzeme kullanarak lazer mikrodiseksiyon için membran slaytlardaki bölümler toplamak. Membran slaytlar bir kurutma kuluçka 37 ° C’de gecede kuru. Moleküler biyoloji sınıf çözümlerle15 uygun H & E yordamı kullanarak ve Hematoksilen boyama zamanı 6 dk ile artan leke. Gerekirse, uygun immunohistokimyasal protokolleri16membran slaytlarla leke. 2. lazer mikrodiseksiyon Slayt sınırları ayarlamak ve sahne hareket kalibre. Lazer görünümü bir membran slayda boş bir alanı taşıyın. Lazer odak odak aralıkları (% 5) membran delmek lazer başlayana kadar artırmaya vurdu bir lazer kovarak kalibre. Beraberlik ve microdissect herhangi bir şekil ve finetune lazer diseksiyon sırasında lazer verimliliği maksimize etmek için lazer odak. Nerede lazer diseksiyon verimliliği uzlaşma bir noktaya sahne hareket hızını artırın. Seçili objektif lens, lazer kalibre ve hedefleri (lazer hız 1-), % 70-75 odak ve güç % 90-100 4 X objektif kullanırken değişen Eğer yeniden kalibre. 4 X amacı istimal lekeli membran slaytları tarama. Seçin ve membran slayda mikrodiseksiyon için hedef alanları sarmak. Lazer teşrih 42 mm2en az bir alan. Kayıt alanı örnek homojenizasyon arabellek kullanılacak hacmi belirlemek için kesmiştim. Cap Asansör mekanizması etiketli tüpler için uygun apendiks bağlı disseke bölümünü difüzör kapaklar üzerine almak için kullanın. Disseke bölüm kap alınmaz, çevrenin lazer diseksiyon işlemini yineleyin. 3. doku lizis Not: Birkaç çözümleri ve malzemeler Malzemeler tablobelirtilen kitleri ile birlikte verilir. Bir 60:1 oranında homojenizasyon çözüm ve İndinavir K kullanarak örnek lizis için gerekli homojenizasyon karışımı cilt hazırlayın. Doku alan, girdap 10 için her 1 mm2 için her tüpün içine çözüm homojenizasyon 2.4 µL pipet s maksimum hız ve 5 için oda sıcaklığında santrifüj 2500 x g s. 600 devir / dakikada sallayarak ile Isıtma blok 12-18 h için 65 ° C’de kuluçkaya. 21.000 x g oda sıcaklığında 5 min için de lysates santrifüj kapasitesi. Bir pipet kullanarak, dikkatle net süpernatant Aspire edin ve etiketli bir taze tüp içine dağıtmak. Bu sonuçlar kalitesini azaltabilir gibi doku/membran parçaları aspirating kaçının. Açık süpernatant-80 ° C dondurucuda saklayın. 4. hibridizasyon tabanlı tahlil Aşağıdaki hazırlıkların gerçekleştirin. Lizis karışımı bir kuluçka 37 ° C’de 30 dk için reaktif şişe koyarak önceden sıcak ve karışımı yavaşça INVERSION tarafından. Doku homogenates dondu, oda sıcaklığında erimek ve 30 dk. girdap 37 ° C’de maksimum hızda kuluçka takip örnekleri kuluçkaya. Titreyen kuluçka 54 ° C’de ayarla ve sıcaklık doğrulama seti probe bir 96-şey plaka boş bir kuyuya yerleştirin. 2 h sonra dijital termometre sıcaklık kontrol ve herhangi bir sıcaklık farkı için düzeltmek için kuluçka sallayarak delta sıcaklığı ayarlayın. Tezcan ve girdap ayarla ve reaktif 10 için engelleme sonda s, 5 oda sıcaklığında santrifüj s 2500 x g ve buz üzerinde tutun. Kullanım sırasında İndinavir K şişe buz üzerinde tutun. 46 kHz yakalama boncuk 3 dk, sonra girdap başka bir 3 min için maksimum hızda için solüsyon içeren temizleyicide. Buna göre aşağıdaki reaktifleri ölçekleme tarafından iyi başına 25 µL çalışma boncuk karışımı hazırlayın: nükleaz ücretsiz su, 16.65 µL lizis karışımı, engelleme reaktif, İndinavir k 0.10 µL, 0.50 µL yakalama boncuk, sonda kümesinin 2.50 µL 1.00 µL 4.25 µL. Girdap 10 için çalışma boncuk karışımı s maksimum hızda sonra pipet 25 µL/iyi manyetik ayırma plaka. Pipet 25 µL doku homogenate manyetik ayırma 96-şey plaka ve 25 için eriyik-e doğru boşlukları olarak 3 kuyu homojenizasyon µL. Şeffaf plastik baskı mühür kullanarak manyetik ayırma plaka mühür ve 600 devir / dakikada sallayarak süre 54 ± 1 ° C, kuluçka 18 – 22 h için plaka yer. Bileşen 1 ve 1.67 mL yıkama arabelleği bileşenin 2 RNase free 31,5 mL su yıkama ile 0.1 mL karıştırma tarafından 24 kuyu tampon 1 yıkama arabellek çözüm X hazırlamak. Plaka kuluçka kaldırın. Titreyen kuluçka makinesi sıcaklığı ayarlamak için 50 ± 1 ° c Manyetik ayırma plaka el Manyetik plaka contalara dağ ve yerine kilitlemek. Basınç mührü kaldır ve yerleşmek manyetik boncuklar için 1 dakika bekleyin. Çamaşır adım: plaka lavabo ve leke üzerinde hafifçe bir doku kağıt üzerinde kalıntı çözüm kaldırmak için monte manyetik ayırma plaka tersine çevirin. Bir çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 1 yıkama arabellek çözüm X 100 µL ekleyin ve bekleyin 15 s. plaka 3 kere yıkamak için bu adımı yineleyin. Her şey için ön amplifikatör reaktif 50 µL pipet. Plaka ile bir alüminyum plaka mühür mühür ve 1 dakika oda sıcaklığında 800 rpm’de plaka sallamak. 50 ± 1 ° C, 1 h için 600 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya. 4,9 (çamaşır adım) arasındaki adımları yineleyin. Her şey için amplifikatör reaktif 50 µL pipet. Bir alüminyum plaka mühür ile plaka mühür ve plaka adım 4,10 olduğu gibi salla. 4,9 (çamaşır adım) arasındaki adımları yineleyin. Girdap 10 etiket prob s maksimum hızda. Etiket inceleyebilirsek 50 µL her şey için ekleyin. Mühür ve plaka (adım 4.10) sallamak. Adım (adım yıkama) 4,9 yineleyin. Girdap 10 Streptavidin phycoerythrin (SAPE) maksimum hızda s. SAPE 50 µL her şey için ekleyin. Mühür ve plaka (adım 4.10) sallamak. Kullanım SAPE yıkama arabellek yıkama arabellek çözüm yerine dışında adım 4,9 (çamaşır adım) yineleyin. SAPE yıkama arabelleği 130 µL bir alüminyum plaka mühür ile her şey ve mühür plaka ekleyin. 3 dakika oda sıcaklığında 800 rpm’de plaka sallamak. Başlangıç manyetik boncuk Çözümleyicisi. Üreticinin yönergelerini izleyerek kalibrasyon ve doğrulama yordamı gerçekleştirin. Aşağıdaki parametreleri kullanarak manyetik boncuk analyzer bir iletişim kuralını ayarlayın: örnek boyutu: 100 µL; DD kapısı: 5.000-25.000; Zaman aşımı: 90 s; Boncuk olay/boncuk bölge: 100; ve ileri’yi tıklatın. İlgili boncuk numaraları panelinde seçin ve üretici tarafından belirtildiği gibi ilgili hedef genleri olan boncuk bölgeleri tanımlamak. Yeni bir analiz toplu işlemleri sekmesinden “oluşturmak toplu kullandığınız varolan bir protokol” seçerek ekleyin. Plaka düzen kuyuları Bilinmeyen veya boş, sırasıyla atayın ve örnekleri panelinde her örnek için bir etiket sağlar. Alüminyum plaka mühür 96-iyi tepki plaka kaldırın. Yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık dışarı atmak düğme tabak Tepsi dışarı atmak, plaka manyetik boncuk çözümleyicisine yük. Geri çek’ i tıklatın | Belgili tanımlık çözümlemek başlatmak için Toplu iş çalıştırın . Okuma sonra dışarı atmak ve 96-şey plaka kaldırın. Temiz ve üretici tarafından önerilen gibi manyetik boncuk analyzer kapa. 5. veri analizi Toplu iş| Sonuçları sekmesini, anılan sıraya göre analiz dosyayı seçin ve to.csv dışa aktar düğmesini tıklatın. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak açık the.csv dosyasını. Boncuk sayar gözlemlemek ve herhangi bir sonuç ile < 40 boncuk/bölge atlayabilirsiniz. Boş kuyu değerleri dışarıda ortalama ve standart sapma (SD) ve algılama sınırı (LOD) (boş ortalama + (3xSD)) hedef gen başına. LOD daha düşük olarak algılanmayan küme değerleri.Not: herhangi normalize ifade değerleri tespit edilmemiş ise, örnek veriler yetersiz olarak görür. İfade değerleri üzerinde 20.000 olarak üst duyarlılık sınırın üzerinde düşünün. Bu örneklerin lysates seyreltilmiş ve yeniden analiz. Ham veri gen başı boş ortalama çıkarma. Seçili normalize genler örnek başına geometrik ortalamasını hesaplamak için. İlgili geometrik ortalama tek tek örnek verileri normalleştirmek. Veri bilim platformlarında veri çözümlemek veya algoritmaları kullanılarak tanımlanmış. Veri veri bilim platformu Veri Ekletıklatarak. Veri dosyası İşlemi çalışma alanına sürükleyin ve [Öznitelikleri Seç] operatöre bağlanın bir asıl bileşen analizi (PCA) operatör ve sonra result bağlantı noktası için. Seçin öznitelik işleci normalleştirilmiş gen veri alt kümesini ve meme kanseri alt türü gibi bir nominal değişkeni seçin. Oyuntıklayarak işlemini çalıştırın. Grafik sekmesinde “3D renkli dağılım” grafik tarzı ve nominal değişken renk alanında seçin. 3 boyutlu bir arsa üzerinde PCA veri değişkenliği değerlendirmek.