Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Aprobación ética para el uso de material de tejido de mama en este estudio se obtuvo de la Universidad investigación ética Comité (UREC) de la Universidad de Malta (Ref: 22/2012). 1. preparación de tejido Mediante adecuados procedimientos H & E14, preparar referencia teñido de tejido y digitalmente, escanear diapositivas de referencia durante la microdisección. Con un micrótomo, corte secciones de tejidos de 20 μm en un baño de agua libre de ARNasa a 40 ° C. Recoger las secciones en las diapositivas de la membrana para Microdisección láser utilizando materiales y equipo limpio y descontaminado de Rnasa. Secar los portaobjetos de la membrana a 37 ° C en un incubador de secado durante la noche. La mancha utilizando el apropiado H & E procedimiento15 con soluciones de grado de biología molecular y aumentar el tiempo de tinción de hematoxilina a 6 min. Si es necesario, mancha las diapositivas de la membrana con el apropiado immunohistochemical protocolos16. 2. Microdisección láser Establecer los límites de la diapositiva y calibrar el movimiento de la etapa. Mover el punto de vista de láser en un área vacía de la diapositiva de la membrana. Calibrar el enfoque de láser disparando un láser dispararon aumentando intervalos de enfoque (5%) hasta que el láser comienza a perforar a través de la membrana. Drenaje y microdissect cualquier forma y afinar el foco del láser para maximizar la eficiencia del láser durante la disección del láser. Aumentar la velocidad de movimiento del escenario a un punto donde no se comprometa la eficacia de la disección de láser. Calibrar el laser en la lente del objetivo seleccionado y recalibrar si cambiar objetivos (láser velocidad de 1 – 15%), foco en el 70 – 75% y poder al 90-100% cuando se utiliza el objetivo de 4 X. Analizar los portaobjetos de tinción de membrana usando el objetivo 4 de X. Seleccionar y delimitar las zonas de microdissection de la diapositiva de la membrana. Láser diseccionar un área mínima de 42 mm2. Registro la zona disecada para determinar el volumen homogeneizante del tampón de muestra a utilizar. Utilizar el mecanismo de elevación de tapa para recuperar la sección disecada en las tapas de difusor de tubos etiquetados atado Apéndice correspondiente. Si no se recupera la sección disecada en la tapa, repita la disección del laser de la zona. 3. tejido lisis Nota: Varias soluciones y los materiales se suministran junto con kits de mencionado en la Tabla de materiales. Prepare el volumen requerido de mezcla homogeneización para la lisis de la muestra mediante homogeneización solución y proteinasa K a una proporción de 60: 1. Pipetee 2.4 μL de homogeneizar la solución en cada tubo por cada 1 mm2 de área de tejido, vortex durante 10 s a velocidad máxima y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g. Incubar en un bloque de calentamiento a 65 ° C por 12 a 18 h con agitación a 600 rpm. Centrifugue los lisados a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Usando una pipeta, cuidadosamente aspirar el sobrenadante y dispensar en un tubo etiquetado fresco. Evite aspirar los fragmentos de tejido de la membrana, esto puede reducir la calidad de los resultados. Guarde el sobrenadante en un congelador de-80 ° C. 4. hibridación basada en análisis Realice los siguientes preparativos. Caliente previamente la mezcla de lisis el frasco del reactivo en una incubadora a 37 ° C por 30 min y mezclar suavemente por inversión. Si los homogenados de tejido se congela, descongelar a temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min vórtex las muestras a la velocidad máxima después de la incubación. La incubadora de agitación en 54 ° C y colocar la sonda del kit de validación de la temperatura en un pozo vacío de una placa de 96 pocillos. Después de 2 h Verifique la temperatura en el termómetro digital y ajuste la temperatura del delta de sacudir la incubadora para corregir cualquier diferencia de temperatura. Deshielo y agitar la punta de prueba sistema y bloqueo reactivo para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g y mantener en hielo. Mantenga el frasco de proteinasa K en el hielo durante el uso. Someter a ultrasonidos los granos captura a 46 KHz durante 3 min., luego vortex a máxima velocidad por otros 3 minutos. Preparar una mezcla de grano de trabajo 25 μl por pocillo por ampliar en consecuencia los siguientes reactivos: 4.25 μl de agua libre de nucleasa, 16.65 μl de mezcla de lisis, 1.00 μl del bloqueo reactivo, 0.10 μl de proteinasa K, 0,50 μl de granos de la captura, 2.50 μl de sonda conjunto. Vórtice la mezcla de grano de trabajo durante 10 s a velocidad máxima, luego Pipetear 25 μL/pocillo a la placa de separación magnética. Pipetee 25 μl tejido homogeneizado a una placa de 96 pocillos de separación magnética y 25 μl solución para 3 pozos como los espacios en blanco de homogeneización. Sellar la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y colocar la placa en la incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 – 22 h agitando a 600 rpm. Preparar una solución 1 X wash buffer 24 pozos por 31,5 mL de libre de Rnasa de mezcla agua con 0,1 mL de lavado Tampón mL del componente 1 y 1,67 de componente de tampón de lavado 2. Retire la placa de la incubadora. Ajustar la temperatura de la incubadora agitación 50 ± 1 ° C. Montar la placa de separación magnética en la lavadora de la mano placa magnética y trábela en su lugar. Retire el sello de presión y espere 1 minuto para las bolas magnéticas resolver. Paso de lavado: Invierta la placa de separación magnética montada en el plato sobre el fregadero y la mancha blanca /negra suavemente sobre un papel para quitar la solución residual. Utilizando una pipeta multicanal añadir 100 μl de solución tampón de lavado 1 X en cada pozo y espera 15 s. Repita este paso para lavar la placa 3 veces. Pipetee 50 μl de reactivo previo a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa a 800 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Incubar durante 1 h a 50 ± 1 ° C agitando a 600 rpm. Repita el paso 4.9 (paso de lavado). Pipetee 50 μl del reactivo del amplificador a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa como en el paso 4.10. Repita el paso 4.9 (paso de lavado). Vórtice de la sonda de la etiqueta de 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de la sonda de etiqueta a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10). Repita el paso 4.9 (paso de lavado). Vórtice ficoeritrina estreptavidina (SAPE) durante 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de SAPE a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10). Repita paso 4.9 (paso de lavado) excepto usar el tampón de lavado SAPE en lugar del tampón de lavado. Añadir 130 μl de tampón de lavado SAPE a cada plato así y sellado con un sello de placa de aluminio. Agitar la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Puesta en marcha el analizador de grano magnético. Realizar la calibración y verificación, siguiendo las instrucciones del fabricante. Establecer un protocolo en el analizador de grano magnético usando los siguientes parámetros: tamaño de la muestra: 100 μl; Puerta DD: 5.000 – 25.000; Tiempo de espera: 90 s; Región de evento/grano grano: 100; y haga clic en siguiente. Seleccione los números de cuentas respectivas en el panel y definir las regiones de grano con los genes respectivos destino indicado por el fabricante. Agregar un nuevo análisis seleccionando “crear lote utilizando un protocolo existente” desde la ficha de lotes . En el diseño de la placa designar los pozos como desconocido o en blanco, respectivamente y proporcionar una etiqueta para cada muestra en el Panel muestras . Retire el sello de placa de aluminio de la placa de 96 pocillos de reacción. Abrir la bandeja de la placa haciendo clic en el botón de expulsión , la placa de carga en el analizador de grano magnético. Haga clic en retractarse| Ejecutar por lotes para iniciar el analizador. Después de leer, expulse y retire la placa de 96 pocillos. Limpiar y cerrar el analizador de grano magnético según lo recomendado por el fabricante. 5. Análisis de datos En el lote| Ficha de resultados , seleccione el archivo de los análisis respectivos y haga clic en el botón exportar to.csv . The.csv abrir archivo usando un software de hoja de cálculo. Observar las cuentas de perla y omitir ningún resultado, < 40 granos/región. Promedio de los valores de los pocillos del blanco y calcular la desviación estándar (SD) y límite de detección (LOD) (espacio en blanco media + (3xSD)) por el gene de la blanco. Establecer los valores más bajo que el LOD como desapercibido.Nota: Si cualquiera de los valores de expresión normalización son detectado, mirar los datos de la muestra como inadecuada. Considerar valores de expresión más 20.000 como sobre el límite de sensibilidad superior. Los lisados de estas muestras deben diluirse y volver a analizar. Reste el promedio en blanco de los datos crudos por gene. Calcular la media geométrica de los genes de normalización seleccionados por muestra. Normalizar datos individuales de la muestra para la media geométrica respectiva. Análisis de datos en plataformas de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos. Importar los datos en la plataforma de la ciencia de datos haciendo clic en Agregar datos. Arrastre el archivo de datos en el Proceso de trabajo y conectar a un operador [Seleccionar atributos] , luego a un principales análisis de componentes (ACP) operador y luego al puerto de t resul. En el Atributo seleccionar operador seleccionar el subconjunto de datos de genética normalizada y una variable nominal como subtipo de cáncer de mama. Ejecutar el proceso haciendo clic en jugar. En la ficha gráficos seleccione la “dispersión de Color 3D” en el estilo de tabla y la variable nominal en el campo de Color . Evaluar la variabilidad de los datos PCA en una parcela de 3 dimensiones.