Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы
Summary
Нуклеиновые кислоты деградации в архивных тканей, опухоли неоднородность и отсутствие образцов свежий замороженные ткани может негативно сказаться на рак диагностические услуги в патологии лабораториях во всем мире. Эта рукопись описывает оптимизации группы биомаркеров, используя пробирного мультиплекс магнитный шарик для классификации рака груди.
Abstract
Нуклеиновые кислоты деградации в архивных тканей, опухоли неоднородность и отсутствие образцов свежий замороженные ткани может негативно сказаться на рак диагностические услуги в патологии лабораториях во всем мире. Амплификации генов и выражение диагностическое тестирование с использованием архивных материалов или материал, который требует транспорт для обслуживания лабораториями, нуждается в более надежной и точной тест, адаптированных к текущих клинических процессов. Наша исследовательская группа оптимизированного использования Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (термо Фишер научных) для количественного определения РНК в архивных материалов, с использованием технологии разветвленной ДНК (bDNA) на Luminex xMAP® магнитные бусы. Пробирного выражение гена, описанные в этой рукописи — роман, быстрый и мультиплексной метод, который может точно классифицировать рака молочной железы в различных молекулярных подтипы, опуская субъективности интерпретации присущей методы визуализации. Кроме того из-за низкой ввода необходимых материалов, гетерогенных опухоли могут быть лазерной microdissected с помощью гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных секций. Этот метод имеет широкий спектр возможных применений, включая классификации опухоли с диагностический потенциал и измерение биомаркеров в жидком биопсий, которые позволили бы лучше пациента управления и мониторинга заболеваний. Кроме того количественные измерения биомаркеров в архивных материалов является полезным в онкологии исследований с доступ к библиотекам клинически Аннотированная материала, в котором можно проверить ретроспективные исследования потенциальных биомаркеров и их клинических исходов корреляции.
Introduction
Оптимизация РНК на основе анализов с использованием архивных формалин Исправлена парафин врезанных (FFPE) материал является сложной задачей вследствие изменчивости в ткани хирургической обработки и деградации РНК, вызванных формалин, используемый для сохранения целостности тканей в1, 2. Чтобы преодолеть ограничение проведения точных ген выражение исследования из архивных материалов, наша группа используется bDNA мультиплекс магнитный шарик assay. Вместо ферментационная амплификация Целевой шаблон bDNA технология использует гибридизации конкретных зондов и усиления сигнала репортер3. Последовательности коротких признание захвата и обнаружения датчиков предназначены для гибридизируйте короткие фрагменты целевой РНК4. Кроме того использование ткани гомогенатах как прямой исходного материала в этот assay, преодолевает неизбежные потери РНК, что результаты анализов, требующих предварительного РНК добычи и очистки. Усиления сигнала, использования коротких распознавания последовательностей и исключения шага очистки, способствуют сокращению технических разновидность assay. Технология обеспечивает возможность мультиплекс пробирного (до 80 целей РНК) и измерить выражение группы целей от низкого входного материала. Этот протокол описывает подготовку и окрашивания образцов ткани для лазерной microdissection. Окрашивание на слайдах мембраны облегчить изображений опухоли и гистологической архитектуры для обеспечения тщательного отбора и профилирование: (1 опухоли и нормальной воздуховодов в ткани молочной железы и (2) злокачественных клеток клоны в гетерогенных опухоли.
Молекулярной классификации рака молочной железы является процессом, который допрашивает молекулярных маркеров для классификации пациентов опухоли в три молекулярных классы, т.е., рецептор Люминал, человека эпидермального фактора роста 2 (HER2)-обогащенный и базальных подтип. HER2-обогащенный подтип четко определены, с высокая экспрессия рецептора HER2, из-за амплификации генов ERBB2, в сочетании с низкой или отсутствии эстрогеновый рецептор (Эр) и рецепторы прогестерона (ГРР). Люминал подтип положительными для ER и базальной подтипа в общем негативном для трех рецепторов (HER2, ER, ГРР) и значительно перекрывается с тройной отрицательный груди Рак (ТНРМЖ) диагностических подтипа5,6. Другие маркеры используются для определения характеристики эпителиальных и мезенхимы. Фибронектина (FN1) является основным компонентом отсеке мезенхимальных ткани груди. Увеличение FN1 выражение сопровождается высокой Ki67 окрашивание и показана сигнатура для более инвазивные опухоли7,8 и связан с метастазированием9. Интересно, что было обнаружено FN1 присутствовать в микровезикулы, возникая от опухолевых клеток, которые индуцированной активации митогенный сигналов в10получателей фибробластов. Следовательно циркулирующих микровезикулы, таких как exosomes маркер потенциал раннего обнаружения или метастазов и рецидивов11.
Выбор области опухоли для подтипов транскрипционный анализ рака груди периодически были произведены macrodissection12,13. Чтобы преодолеть гетерогенность ткани и увеличить чувствительность, мы объединили надежно окрашивания с мультиплексной молекулярная профилируя методы классической ткани. Как доказательство принципа были определены два отдельных груди Рак клоны их эпителиального мезенхимальных подписью и метастатическим потенциалом. Рабочий процесс описан протокола можно легко переводится в текущих клинических установки и используется выборочно изолировать и характеризуют подтипы ткани с помощью целенаправленных мРНК профилирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
На основе бисера мультиплекс bDNA пробирного был оптимизирован для количественного определения экспрессии генов на деградированных РНК, производные от FFPE ткани рака молочной железы и нормальной груди воздуховодов. Оптимизация assay, участвующих развивающихся алгоритм классификации опухолей молочной железы рак в Люминал и базальной подтипы, используя 8 биомаркеров известных и потенциальных 5 нормализующее генов. Нормализация данных было сделано с помощью перестановок нормализующее генов. Выбор нормализующее генов был основан на лучший прогноз рецептор статуса с помощью Люминал/базальной классификатор генов. Для классификации Люминал/базальной подтипы из FFPE тканей, нормализации гены выбран были бета актина (ACTB), Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) и гипоксантин Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Метод может быть адаптирована для использования в других диагностических и областей исследования, после надлежащего отбора нормализующее набора генов. Один из важных применение этого метода в научно-исследовательском секторе является измерение биомаркеров в архивных материалов, которые хорошо аннотированных с клиническим исходам. Это может проверять потенциальных прогнозирования маркеров в ретроспективных исследований, быстро и точно и избежать долгосрочных перспективных исследований, ожидающих безрецидивной выживаемости и общей выживаемости данных. В настоящее время наша группа изучает использование проба для выявления рецептор положительным exosomes, который требует разработки нового алгоритма, используя альтернативный нормализующее генов для нормализации данных. Использование жидкого биопсии и надежные ген выражение анализов позволит высокой пропускной способности мультиплекс анализов, приспособленных для управления пациента во время лечения и предоставляют возможность следить за эффективностью лечения, возможных рецидивов из-за резистентности к терапии и метастатического потенциала опухоли.
Этот метод также имеет широкий спектр возможных применений в диагностике опухолей и адаптирована к текущей диагностики рабочего процесса. Основные преимущества этого метода в области диагностики включают в себя: (1) осуществление анализов высокой пропускной способности, (2) за исключением субъективности и двусмысленные результаты возникая от измерений на основе образов, (3) точное обнаружение нескольких целей одновременно, который повысить точность и свести к минимуму использование драгоценных пациентов образцов и (4) не требуется высоко специализированных учреждений и людских ресурсов. Процесс оптимизированной выборки, вместе с низкой ввода материала, необходимого для на базе шарик мультиплекс assay, позволяет дальнейшее расследование неоднородности опухоли; с помощью лазерной microdissection точно отделить несколько очагов злокачественных тканей из секции же пациента, его можно сравнить несколько экспрессии генов между ними, а также с соответствует нормальной ткани (рис. 4). Низкий материальный вклад имеет жизненно важное значение для диагностики приложения на биопсии опухоли, которые предоставляют ограниченные опухолевой ткани. Assay способность измерения экспрессии генов от деградированных РНК образцов позволяет легко транспортировки проб для анализа в учреждение или на обслуживание лабораторий. Кроме того целый раздел анализ был также возможно с использованием материала (рис. 1) запятнанных H & E.
Для успеха этого протокола, важно, чтобы: (1) обеспечить надлежащего отбора проб опухоли сайта/s, что лизированы для assay и (2) разработка хорошо оптимизированы и проверены алгоритмы нормализации данных, для каждой панели выражение гена и/или индивидуальных модельных или интеллектуального биомаркеров. Бывший зависит от технического опыта техник/ученого выполнения выборки. Рекомендуется принять дополнительные ядра и подготовить microarray ткани (TMA) в том же формате пробирного мультиплекс магнитный шарик (96-луночных формат). Это даст Архив опухоли сайты как копия образцов для анализа на базе РНК. TMAs может также оцениваться с другими методами для последующего исследования или проверки достоверности результатов. Разработка алгоритмов нормализации зависит от материала проводится расследование и нормализующее генов, отобранных для нормализации. Различные панели нормализации гены выбираются на основе уровня и изменчивости выражения в образце проанализированы и это колеблется от рака тканей из различных источников, exosomes плазмы, или циркулирующих клеток опухоли. Проверка анализа включает в себя пример обработки, поскольку различные препараты также приведет к нормализации различных алгоритмов.
Подводя итоги, использование bDNA технологии в сочетании с технологией магнитной бусины и выбор правильного группы генов-мишеней, обеспечит дополнительное преимущество измерения экспрессии генов непосредственно в ткани лизатов производным от небольших количеств пациента материала, включая материал, exosomes microdissected и циркулирующих клеток опухоли. Помимо обнаружения опухоли гетерогенности надлежащее использование панелей имеет потенциал для обнаружения опухоли производные exosomes для ранней диагностики и раннего выявления рецидивов. Так как нет необходимости для шага амплификации нуклеиновых кислот, усиления сигнала, используя bDNA технология, в сочетании с на основе бисера мультиплекс, меры несколько экспрессии генов в клинически Аннотированная архивных материалов и обеспечение ресурсов для Проверка биомаркеров.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана (1) груди Рак проекта стипендию (2014-2016) финансируется Фонд рака молочной железы и живой 2013 через исследования, инновации и развитие доверия (RIDT) из Университета Мальты, (2) на факультете медицины & Хирургии, Университет Мальты и (3) проекта закона финансируется Мальтийский совет по науке и технологии через слияние: R & I 2016 программы развития технологии. Публикация этой рукописи поддерживается через Jove-Luminex Грант.
Materials
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes–dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lin, F., Prichard, J. . Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
