Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Aprovação ética para uso de material de tecido mamário neste estudo foi obtida da Universidade pesquisa ética Comitê (UREC) da Universidade de Malta (Ref: 22/2012). 1. tecido preparação Usando o apropriado H & E procedimentos14, preparar referência manchada cortes histologicos e digitalmente digitalizar slides para referência durante microdissection. Usando um micrótomo, corte 20 seções de tecidos µm para um banho de água livre de RNAse a 40 ° C. Recolha as seções sobre slides de membrana para o laser microdissection usando materiais e equipamento limpo e descontaminado de RNase. Seca as lâminas de membrana a 37 ° C numa incubadora de secagem durante a noite. Mancha usando o apropriado H & E procedimento15 com soluções de grau de biologia molecular e aumentar o tempo de coloração de hematoxilina-6 min. Se necessário, mancha os slides de membrana com a imuno-histoquímica adequados protocolos16. 2. laser Microdissection Definir os limites de slide e calibrar o movimento de palco. Mova a vista do laser em uma área vazia de um slide de membrana. Calibre o foco do laser por disparar um laser atirou em intervalos de foco (5%) a aumentar até o laser começa a perfurar através da membrana. Empate e microdissect qualquer forma e finetune o foco do laser para maximizar a eficiência do laser durante a dissecção do laser. Aumente a velocidade de movimento de palco a um ponto onde a eficiência de dissecação do laser não é comprometida. Calibrar o laser para o selecionado da lente objetiva e re-calibrar se alterando objectivos (laser 1 – 15% de velocidade), foco em 70-75% e o poder em 90-100% quando se utiliza o objectivo X 4. Digitalizar slides membrana manchada usando o objectivo X 4. Selecione e cercar as áreas-alvo para microdissection do slide de membrana. Laser dissecar uma superfície mínima de 42 mm2. Registro da área dissecada para determinar o volume de amortecedor homogeneização da amostra a ser usado. Use o mecanismo do elevador de tampa para recuperar a seção dissecada para as tampas de difusor de tubos etiquetados anexado para o apêndice apropriado. Se a seção dissecada não é obtida para a tampa, repita a dissecação do laser da área. 3. tecido Lysis Nota: Várias soluções e materiais são fornecidos juntamente com kits de mencionado na Tabela de materiais. Prepare o volume necessário de mistura homogeneização para lise de amostra usando a homogeneização solução e proteinase K em uma relação de 60:1. Pipete 2.4 µ l de homogeneizar a solução em cada tubo para cada 1mm2 de área de tecido, vórtice para 10 s na velocidade máxima e centrifugar a temperatura ambiente por 5 s a 2.500 x g. Incube em um bloco de aquecimento a 65 ° C por 12 – 18 h com agitação a 600 rpm. Centrifugue os lysates a 21.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Utilizando uma pipeta, cuidadosamente Aspire o sobrenadante claro e dispense em um tubo rotulado de fresco. Evite aspirar os fragmentos de tecido/membrana como isto pode reduzir a qualidade dos resultados. Armazene o sobrenadante claro em um freezer-80 ° C. 4. com base em hibridação ensaio Execute as seguintes preparações. Pré-aquecer a mistura de Lise, colocando o frasco de reagente na incubadora a 37 ° C por 30 min e misture suavemente por inversão. Se o tecido homogenates são congelados, descongelar à temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min. Vortex as amostras à velocidade máxima após a incubação. Definir a incubadora agitando a 54 ° C e coloque a sonda do kit de validação de temperatura em um poço vazio de uma placa de 96 poços. Após 2 h verificar a temperatura do termômetro digital e regule a temperatura do delta de tremer a incubadora para corrigir qualquer diferença de temperatura. Degelo e vortex a sonda definida e bloqueio de reagente para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente por 5 s em 2.500 x g e manter no gelo. Mantenha o frasco de Proteinase K no gelo durante o uso. Proceda à sonicação os grânulos de captura de 46 KHz por 3 min, então vórtice na velocidade máxima por mais 3 minutos. Preparar uma mistura de grânulo de trabalho µ l 25 por alvéolo pela ampliação em conformidade os seguintes reagentes: 4,25 µ l de água livre de Nuclease, 16.65 µ l da mistura de Lise, 1,00 µ l de reagente 0,10 µ l de Proteinase K, 0,50 µ l de grânulos de captura, 2,50 µ l de sonda conjunto de bloqueio. Vórtice o mix de grânulo de trabalho para 10 s velocidade máxima, em seguida Pipetar 25 µ l/poço para a placa de separação magnética. Pipetar 25 µ l tecido homogeneizado para uma placa de 96 poços de separação magnética e 25 µ l de solução 3 poços como os espaços em branco de homogeneização. A placa de separação magnética usando um selo de pressão de plástico transparente do selo e coloque a placa na incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 a 22 h agitando a 600 rpm. Prepare uma solução tampão de lavagem de 1x para 24 poços misturando água 31,5 mL de RNase-livre com 0,1 mL de lavagem do buffer componente 1 e 1,67 mL de componente de tampão de lavagem 2. Retire a placa da incubadora. Regule a temperatura da incubadora a agitação de 50 ± 1 ° C. Fixar a placa de separação magnética na máquina de lavar à mão placa magnética e trave no lugar. Remova o selo de pressão e esperar 1 min para os grânulos magnéticos resolver. Etapa de lavagem: Inverta a placa de separação magnética, montada sobre o prato sobre a pia e a mancha suavemente sobre um papel absorvente para retirar a solução residual. Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 µ l de 1 X solução de tampão de lavagem em cada poço e espere 15 s. Repita este passo para lavar a placa 3 vezes. Pipete 50 µ l de reagente pré-amplificador para cada poço. A placa do selo com um selo de chapa de alumínio e agitar a placa a 800 rpm durante 1 min à temperatura ambiente. Incube durante 1 h a 50 ± 1 ° C e agitando a 600 rpm. Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem). Pipete 50 µ l de reagente de amplificador para cada poço. A placa do selo com um selo de chapa de alumínio e agitar a placa como na etapa 4.10. Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem). Vórtice da sonda de rótulo para 10 s na velocidade máxima. Adicione 50 µ l da sonda de rótulo para cada poço. Fechar e agitar a placa (passo 4.10). Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem). Vórtice a Streptavidin ficoeritrina (SAPE) por 10 s na velocidade máxima. Adicione 50 µ l de SAPE a cada poço. Fechar e agitar a placa (passo 4.10). Repita etapa 4.9 (etapa de lavagem) exceto uso o tampão de lavagem SAPE em vez de solução-tampão de lavagem. Adicione 130 µ l de tampão de lavagem SAPE para cada prato bem e selo com um selo de chapa de alumínio. Agite a placa a 800 rpm, à temperatura ambiente por 3 min. Arranque o analisador magnético do grânulo. Realizar a calibração e verificação de rotina, seguindo as instruções do fabricante. Configurar um protocolo sobre o analisador magnético do grânulo, usando os seguintes parâmetros: tamanho da amostra: 100 µ l; Portão DD: 5.000 – 25.000; Tempo limite: 90 s; Região do evento/pérola grânulo: 100; e clique em Avançar. Selecione os números respectivos grânulo no painel e definir as regiões de grânulo com os genes de destino correspondente, conforme indicado pelo fabricante. Adicione uma nova análise, selecionando “lote criar usando um protocolo existente” da guia lotes . No layout de placa designar os poços como desconhecido ou em branco, respectivamente e fornecer um rótulo para cada amostra no painel amostras . Remova o selo de placa de alumínio da placa de 96 poços de reação. Ejetar a bandeja da placa clicando no botão Eject , carregar a placa para o analisador magnético do grânulo. Clique em retrair| Lote de executar para iniciar o analisador. Após a leitura, ejetar e retire a placa de 96 poços. Limpar e desligar o analisador magnético do grânulo, conforme recomendado pelo fabricante. 5. análise de dados No lote| Guia de resultados , selecione o arquivo de análise respectivos e clique no botão Exportar to.csv . The.csv aberto arquivo usando um software de planilha eletrônica. Observar as contagens do grânulo e omitir qualquer resultado com grânulos de 40 </região. Média, os valores dos poços em branco e elaborar o desvio padrão (SD) e limite de deteção (LOD) (em média de branco + (3xSD)) por gene alvo. Defina os valores mais baixos do que o LOD como sem ser detectado.Nota: Se qualquer um dos valores de expressão de normalização são detectadas, considere os dados de exemplo como inadequada. Considere valores de expressão mais 20.000 como acima do limite superior de sensibilidade. Os lysates destas amostras deve ser diluídos e re-analisados. Subtrai a média em branco a partir dos dados brutos por gene. Calcule a média geométrica dos genes normalizando selecionados por amostra. Normalize os dados de amostra individual para a respectiva média geométrica. Analise os dados em plataformas de ciência de dados ou usando algoritmos definidos. Importe os dados para a plataforma de ciência de dados clicando em Adicionar dados. Arraste o arquivo de dados para o Processo de trabalho e conectar a um operador [Selecione atributos] , então um principais (PCA) da análise de componentes operador e depois para o porto de t resul. No Atributo selecione operador selecionar o subconjunto de dados normalizado gene e uma variável nominal como subtipo de câncer de mama. Execute o processo clicando em jogar. Na guia gráficos , selecione o “Scatter cor 3D” no estilo gráfico e a variável nominal no campo de cores . Avalie a variabilidade de dados PCA em um terreno de 3-dimensional.