Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Approvazione etica per l’uso di materiale di tessuto del seno in questo studio è stato ottenuto da università ricerca etica Comitato (UREC) dell’Università di Malta (Ref: 22/2012). 1. tessuto preparazione Utilizzando appropriati H & E procedure14, preparare riferimento macchiato le sezioni di tessuto e scansione digitale le diapositive per riferimento durante microdissection. Con un microtomo, tagliare 20 µm sezioni di tessuti su un bagno di acqua RNAsi-libera a 40 ° C. Raccogliere le sezioni sulle diapositive di membrana per il laser microdissection utilizzando materiali e attrezzature pulite, RNasi-decontaminati. Asciugare i vetrini di membrana a 37 ° C in un incubatore di essiccazione durante la notte. Macchia usando l’appropriata procedura H & E15 con soluzioni di grado di biologia molecolare e aumentando il tempo di colorazione di ematossilina a 6 min. Se necessario, macchia le diapositive di membrana con i protocolli appropriati immunohistochemical16. 2. laser Microdissection Impostare i limiti di diapositiva e calibrare il movimento scenico. Spostare la vista laser in un’area vuota di una diapositiva di membrana. Tarare il laser fuoco sparando un laser sparato ad aumentare gli intervalli di messa a fuoco (5%) fino a quando il laser inizia a perforare attraverso la membrana. Draw e microdissect qualsiasi forma e finetune il fuoco del laser per massimizzare l’efficienza del laser durante la dissezione laser. Aumentare la velocità di movimento di fase in un punto dove l’efficienza di dissezione laser non è compromessa. Tarare il laser alla lente dell’obiettivo selezionato e ri-calibrare se cambiando gli obiettivi (laser velocità: 1 – 15%), messa a fuoco al 70-75% e potenza al 90 – 100% quando si utilizza l’obiettivo 4x. Scansione le diapositive di membrana macchiato usando l’obiettivo 4x. Selezionare e circondare le zone di destinazione per microdissezione sulla diapositiva della membrana. Laser sezionare una superficie minima di 42 mm2. Record della zona sezionato per determinare il volume di tampone omogeneizzazione del campione da utilizzare. Utilizzare il meccanismo di sollevamento tappo per recuperare la sezione dissecata sui tappi di diffusore di provette attaccato all’annesso appropriato. Se la sezione dissecata non viene recuperata sul cappuccio, ripetere la dissezione laser della zona. 3. tessuto Lisi Nota: Diverse soluzioni e materiali sono forniti insieme al kit menzionato nella Tabella materiali. Preparare la quantità necessaria di miscela d’omogeneizzazione per lisi del campione mediante omogeneizzazione soluzione e proteinasi K con un rapporto di 60: 1. 2.4 µ l di soluzione di omogeneizzazione in ciascuna provetta per ogni 1 mm2 di area di tessuto, vortexare per 10 s a velocità massima e centrifuga a temperatura ambiente per 5 s a 2.500 x g. Incubare in un blocco di riscaldamento a 65 ° C per 12 – 18 h con agitazione a 600 giri/min. Centrifugare i lisati a 21.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta, attentamente aspirare il supernatante chiaro e pipettare in una provetta etichettata fresca. Evitare di aspirare i frammenti di tessuto/membrana, in quanto ciò potrebbe ridurre la qualità dei risultati. Conservare il supernatante chiaro in un congelatore a-80 ° C. 4. test di ibridazione Eseguire le seguenti operazioni preparatorie. Pre-riscaldare la miscela di lisi inserendo il flacone di reagente in un incubatore a 37 ° C per 30 min e mescolare delicatamente per inversione. Se gli omogenati sono congelati, scongelare a temperatura ambiente e incubare a 37 ° C per 30 min. Vortex i campioni alla massima velocità dopo l’incubazione. Impostare l’incubatore agitazione a 54 ° C e posizionare la sonda del kit temperatura convalida in un pozzetto vuoto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo 2 h controllare la temperatura sul termometro digitale e impostare la temperatura di delta di agitazione incubatore per correggere qualsiasi differenza di temperatura. Disgelo e vortice la sonda impostata e bloccando il reagente per 10 s, centrifuga a temperatura ambiente per 5 s a 2.500 x g e tenere sul ghiaccio. Tenere il flaconcino di proteinasi K sul ghiaccio durante l’uso. Sonicare le perline di cattura a 46 KHz per 3 min, poi vortice alla massima velocità per un altro 3 min. Preparare un 25 mix di perle di lavoro µ l per pozzetto di scalabilità di conseguenza i seguenti reagenti: 4,25 µ l di acqua priva di nucleasi, 16.65 µ l di miscela di Lisi, 1.00 µ l di blocco 0.10 µ l di proteinasi K, 0,50 µ l di cattura perline, reagente, 2.50 µ l di sonda insieme. Vortice il mix di perle di lavoro per 10 s a velocità massima, quindi Pipettare 25 µ l/pozzetto nella piastra di separazione magnetica. Dispensare 25 µ l del tessuto omogeneizzato per una piastra a 96 pozzetti separazione magnetica e 25 µ l di soluzione di 3 pozzi come gli spazii in bianco di omogeneizzazione. Sigillare la piastra di separazione magnetica utilizzando un sigillo di plastica trasparente pressione e posizionare la piastra nell’incubatore a 54 ± 1 ° C per 18 – 22 h mentre si stringono a 600 giri/min. Preparare una soluzione tampone di lavaggio di 1x per 24 pozzetti mescolando 31,5 mL di RNAsi-libera acqua con 0,1 mL di wash buffer componente 1 e 1,67 mL del componente di tampone di lavaggio 2. Rimuovere la piastra dall’incubatore. Impostare la temperatura dell’incubatore d’agitazione a 50 ± 1 ° C. Montare la piastra di separazione magnetica sulla rondella piastra magnetica portatile e bloccarlo in posizione. Rimuovere il sigillo di pressione e attendere 1 min per i branelli magnetici a stabilirsi. Fase di lavaggio: Capovolgere la piastra di separazione magnetica montata sulla piastra sopra il lavandino e la macchia delicatamente su una carta velina per rimuovere i residui della soluzione. Usando una pipetta multicanale aggiungere 100 µ l di soluzione tampone di lavaggio: 1x in ciascun pozzetto e aspettare 15 s. Ripetere questo passaggio per lavare la piastra 3 volte. Pipettare 50 µ l del reagente pre-amplificatore in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con un sigillo di piastra in alluminio e scuotere la piastra a 800 rpm per 1 min a temperatura ambiente. Incubare per 1 h a 50 ± 1 ° C mentre si stringono a 600 giri/min. Ripetere il passaggio 4.9 (fase di lavaggio). Pipettare 50 µ l del reagente amplificatore in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con un sigillo di piastra in alluminio e scuotere la piastra come descritto al punto 4.10. Ripetere il passaggio 4.9 (fase di lavaggio). Vortice della sonda di etichetta per 10 s a velocità massima. Aggiungere 50 µ l di sonda etichetta ad ogni pozzetto. Sigillare e scuotere la piastra (passo 4,10). Ripetere i passaggio 4.9 (fase di lavaggio). Vortice la ficoeritrina streptavidina (SAPE) per 10 s a velocità massima. Aggiungere 50 µ l di SAPE in ciascun pozzetto. Sigillare e scuotere la piastra (passo 4,10). Ripetere il passo 4.9 (fase di lavaggio) l’eccezione di usare il tampone di lavaggio SAPE invece la soluzione tampone di lavaggio. Aggiungere 130 µ l di tampone di lavaggio SAPE per ogni pozzo e guarnizione piastra con un sigillo di piastra in alluminio. Agitare la piastra a 800 giri/min a temperatura ambiente per 3 min. Start-up l’analizzatore di biglie magnetiche. Eseguire la routine di calibrazione e verifica seguendo le istruzioni del produttore. Istituire un protocollo sull’analizzatore Beads magnetiche utilizzando i seguenti parametri: dimensione del campione: 100 µ l; Cancello DD: 5.000-25.000; Timeout: 90 s; Regione di evento/tallone tallone: 100; e fare clic su Avanti. Selezionare i numeri rispettivi tallone nel pannello e definire le regioni di perlina con geni rispettivi target come indicato dal produttore. Aggiungere una nuova analisi selezionando l’opzione “creare Batch utilizzando un protocollo esistente” dalla scheda batch . Nel layout di piastra designare i pozzi come sconosciuto o vuoto, rispettivamente e fornire un’etichetta per ogni campione nel pannello campioni . Rimuovere la guarnizione del piatto di alluminio dalla piastra 96 pozzetti di reazione. L’espulsione del piatto facendo clic sul pulsante di espulsione , la piastra di carico nell’analizzatore biglie magnetiche. Fare clic su ritrarre| Esecuzione Batch per avviare l’analizzatore. Dopo la lettura, espellere e rimuovere la piastra a 96 pozzetti. Pulire e arrestare l’analizzatore di biglie magnetiche, come raccomandato dal produttore. 5. analisi dei dati Nel Batch| Scheda risultati , selezionare il file di analisi corrispondente e fare clic sul pulsante Esporta to.csv . File CSV aperto utilizzando un software di foglio di calcolo. Osservare i conteggi di perlina e omettere alcun risultato con < 40 perline/regione. La media di valori dei pozzetti bianchi e lavorare fuori la deviazione standard (SD) e il limite di rilevamento (LOD) (blank media + (3xSD)) al gene bersaglio. Impostare i valori inferiori al LOD come inosservato.Nota: Se uno dei valori dell’espressione normalizzante inosservato, considerare i dati di esempio come inadeguata. Prendere in considerazione i valori dell’espressione oltre 20.000 come oltre il limite di sensibilità superiore. I lisati di questi campioni devono essere diluiti e ri-analizzati. Sottrarre la media vuota dai dati grezzi a gene. Calcolare la media geometrica di geni selezionati normalizzante per campione. Normalizzare i dati campione individuale per la rispettiva media geometrica. Analizzare i dati su piattaforme di scienza di dati o utilizzando algoritmi definiti. Importare i dati nella piattaforma di scienza di dati facendo clic su Aggiungi dati. Trascinare il file di dati nel Processo di area di lavoro e connettersi ad un operatore [Seleziona attributi] , quindi a un principali analisi dei componenti (PCA) operatore e quindi alla porta t resul. Nell’ Attributo selezionare operatore selezionare il sottoinsieme di dati normalizzati genica e una variabile nominale come sottotipo di cancro al seno. Eseguire il processo facendo clic su Play. Nella scheda tabelle selezionare la “dispersione 3D colore” nello stile grafico e la variabile nominale nel campo del colore . Valutare la variabilità di dati PCA su un terreno di 3-dimensionale.